PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG:

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC

3.4.PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG:

Năm 1975, kĩ thuật tạo kháng thể đơn dòng hybridoma ra đời đã tạo nên một cuộc cách mạng trong việc sản xuất kháng thể đơn dòng. Phương pháp này được tiến hành như sau:

 Tiêm kháng nguyên vào chuột. Tách tế bào lá lách chuột (là nơi kháng thể được tạo thành) trộn với tế bào myeloma (tế bào bạch cầu ung thư). Bổ sung polyethylene glycol vào dịch huyền phù chứa hỗn hợp 2 loại tế bào trên. Hỗn hợp nuôi cấy tạo ra tế bào lai.

 Nuôi hỗn hợp trên trong môi trường chọn lọc chứa HAT (một hỗn hợp của hypoxanthine, amionpterin và thymidine). Tế bào lá lách chuột (kháng được HAT) sẽ phát triển bình thường trong một thời gian, còn tế bào myeloma (không kháng được HAT) sẽ chết ngay. Tế bào lai phát triển bình thường do có 2 đặc điểm: phân chia vô hạn (nhận được từ tế bào myeloma) và có các chất trao đổi cần thiết (nhận được từ tế bào lá lách chuột).

 Thu nhận tế bào lai nổi trên bề mặt môi trường. Tiến hành tạo dòng ở qui mô in vitro hoặc tiêm tế bào lai vào khoang bụng của chuột. Chuột sẽ sản xuất ra những khối u có chứa chất dịch giàu kháng thể.

Ngày nay, bên cạnh sự phát triển của công nghệ di truyền, con người vẫn sử dụng phương pháp này để sản xuất kháng thể đơn dòng.

Hình 3.13. Sơ đồ kĩ thuật tạo kháng thể đơn dòng hybridoma

 Ví dụ:Sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu với-glytamyl transpeptidase. -glytamyl transpeptidase (EC 2.3.2.2) là enzyme xúc tác cho sự thuỷ phân và chuyển vị của nhóm -glytamyl. Nó có liên quan đến quá trình khử độc ở màng tế bào, sự vận chuyển amino acid, peptide ở gan và sự hình thành ammoniac ở thận. Để định lượng enzyme này, người ta sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với - glytamyl transpeptidase trong phương pháp ELISA [17].

Các bước tiến hành:

 Tách enzyme từ thận của tử thi, sau đó hoà tan trong papain, xử lý bằng dung dịch ammonium sulfate 60%, tinh sạch bằng phương pháp sắc ký cột hấp phụ (chất hấp phụ là Sephadex G-150). Enzyme thu nhận sau cùng được dùng làm kháng nguyên trong phương pháp hybridoma.

 Trong tuần đầu tiên, mỗi con chuột đực được tiêm vào dưới da và gan bàn chân 100g kháng nguyên cùng với 1 lượng thích tá dược Freund thích hợp (tá dược Freund là một hệ nhũ tương trong dầu thô tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành kháng thể, có chứa Mycobacterium tuberculosisđã vô hoạt và sấy khô). Sau đó, chúng tiếp tục được tiêm 3 lần trong 2 tuần tiếp theo, mỗi lần tiêm 60 g kháng nguyên và tá dược. Lần tiêm cuối cùng sẽ thực hiện 3 ngày trước khi tiến hành tách tế bào lá lách.

 Trộn 4x108 tế bào lá lách chuột và 8x107 tế bào myeloma, bổ sung thêm PEG. Tiến hành nuôi cấy trên môi trường DMEM (1 loại môi trường có chứa glucose, muối KCl, NaCl, MgSO4, vitamin B2, B3, B9 và một số amino acid) có bổ sung 20% huyết thanh bào thai bê và HAT (100M hypoxanthine, 400M aminopterin và 16M thymidine). Sau một thời gian tiến hành thu nhận tế bào lai nổi lên trên bề mặt môi trường rồi tạo dòng. Nhân tế bào lai sẽ sản xuất ra kháng thể đơn dòng đặc hiệu với-glytamyl transpeptidase.