CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC
3.6.NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG PROTEIN:
Một trong những thành quả quan trọng của kĩ thuật tái tổ hợp DNA là sử dụng đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis) thay thế các amino acid then chốt để nâng cao chất lượng protein. Để chọn đúng điểm thay thế, sự can thiệp của điện toán là không thể thiếu, dẫn đến các thí nghiệm in silico (thí nghiệm trên máy điện toán) mà đến nay đã phát triển thành chuyên ngành mới là tin-sinh học (bioinformatics) [8].
Ví dụ điển hình là biện pháp thay đổi tính ổn định và đặc hiệu của t-PA (Tissue Plasminogen Activator). t-PA được ứng dụng làm tan cục máu đông. Tuy nhiên, nó dễ dàng bị thải ra khỏi dòng máu nên phải tăng nồng độ ban đầu trong xử lý, mà điều này có thể gây thương tổn. Do vậy t-PA mới ra đời với thiết kế như sau:
Thay threonine 103 bằng asparagine làm tăng tính bền vững lên gấp 10 lần trong dòng máu.
Thay đoạn amino acid 296-299 từ lysine-histidine-arginine-arginine thành alanine-alanine-alanine-alanine làm enzyme có tính đặc hiệu cao hơn với fibrin của cục máu.
Thay asparagine 117 làm hồi phục hoạt tính phân huỷ fibrin như enzyme tự nhiên.
Sự tổ hợp của cả 3 đột biến điểm trên tạo ra t-PA mới có đồng thời 3 hoạt tính.
Ngoài ra có thể nâng cao chất lượng protein bằng cách cải tiến cấu tạo phân tử. Trường hợp tiêu biểu là interferon alfa.
Giống như nhiều loại protein lạ khác, interferon alfa nhanh chóng bị thoái hoá khi tiêm vào cơ thể. Hậu quả là nó chỉ tồn tại trong hệ tuần hoàn một thời gian ngắn, như vậy chúng ta cần tiêm nhiều lần trong tuần nhằm duy trì tác dụng của thuốc. Biện pháp này tạo ra nồng độ interferon alfa trong máu cao ngay sau khi tiêm – gắn liền với việc tăng các tác dụng phụ - và các mức nồng độ thấp trong khoảng thời gian giữa các lần tiêm – gắn liền với hiệu quả điều trị bị giảm sút.
Bằng cách gắn thêm nhánh PEG, các nhà khoa học đã giải quyết được khó khăn trên [18]. PEG (polyethylene glycol) là một polymer trơ, hoà tan trong nước, không gây độc, được tạo ra bằng cách kết nối nhiều tiểu đơn vị ethylene oxide. Khi gắn kết PEG vào protein có tác dụng điều trị, nó làm tăng khả năng hoà tan trong
nước, bảo vệ phân tử protein và không sinh miễn dịch. Phần tận cùng của phân tử PEG thường là nhóm hydroxyl –OH. Để tránh kết dính chéo và kết tụ, ta biến đổi 1 nhóm hydroxyl tận cùng thành methoxy không phản ứng, tạo nên monomethoxy PEG (mPEG). 2 nhánh mPEG có phân tử lượng 20 kilodalton sau khi được hoạt hoá bằng hydroxyl succinimide sẽ kết dính vào interferon alfa thông qua tương tác với amino acid lysine, tạo ra loại thuốc mới PEG interferon alfa 40KD có hiệu quả điều trị viêm gan C cao hơn hẳn.
Hình 3.14.Sơ đồ cấu tạo PEG interferon alfa 40 KD
Bước vào thế kỉ XXI, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật, công nghệ chế tạo protein dựa trên nền tảng Genomics, Proteomics, công nghệ RNA, Bioinformatics đang tạo ra thế hệ protein thứ hai, đó là các protein được biến đổi nhằm cải tiến cấu trúc, sự ổn định và các đặc tính sinh học có lợi để nâng cao hiệu quả sử dụng, đáp ứng tốt hơn nhu cầu của con người.