CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC
3.1.3.3. Chất mang rắn:
Yêu cầu: cần phải trơ về mặt hóa học, bền cơ học, không tan trong dung môi được sử dụng và có thể tách ra dễ dàng trong quá trình lọc. Ngoài ra, nó còn phải có đủ số lượng các vùng hoạt hóa để có thể gắn các amino acid đầu tiên của chuỗi peptide vào.
Một số vật liệu làm chất mang được sử dụng: polyethylene, cellulose, controlled pore glass (CPG), chitin…
Một số hình dạng chất mang: dạng màng mỏng, dạng hạt, dạng sợi.
Mức độ amino acid đầu tiên gắn vào chất mang có giá trị tối ưu là 0,2-0,5 mmol/g chất mang. Tốc độ tăng tỉ lệ khối lượng giữa peptide/chất mang thường không làm giảm hiệu quả của quá trình tổng hợp mặc dù khi đó tính chất trương nở trong dung môi không phân cực của chất mang bị giảm đi rõ rệt. Những vật
liệu phân cực hơn (ví dụ polyamide) thường dùng để tổng hợp các peptide mạch dài hơn.
Nhóm chức hoạt động trên chất mang: có thể xem như là tương ứng với nhóm bảo vệ đầu C của peptide (tức là có tác dụng bảo vệ đầu C của peptide). Tùy thuộc vào đầu C của peptide nào mà người ta cần 1 carboxylate, 1 carboxamide, 1 ester hoặc 1 alcohol. Trong hầu hết các trường hợp, amino acid đầu tiên được gắn với chất mang nhờ liên kết ester. Việc lựa chọn phù hợp sẽ giúp quá trình gắn và tách peptide khỏi chất mang thuận lợi, đồng thời tránh được hiện tượng racemic hóa (trong quá trình gắn amino acid đầu tiên).
Chất mang đầu tiên được sử dụng trong SPPS là 1 copolymer của polstyrene và 1-2% divinyl benzene. Hạt chất mang khô có đường kính khoảng 20-80 m và có thể phồng lên đến thể tích lớn hơn thể tích ban đầu từ 5-6 lần tùy loại dung môi (dung môi dùng cho tổng hợp peptide). Do đó, chất mang polymer (thường lơ lửng trong dung môi) không phải dạng mạng rắn (solid matrix) mà ở dạng gel được solvate hóa tốt và chuỗi polymer khá linh động. Điều này giúp cho các chất phản ứng dễ khuếch tán tới các vùng phản ứng. Người ta nhận thấy có thể có khoảng 1012 chuỗi polypeptide giữ trên hạt chất mang polystyrene/divinylbenzene có đường kính 50m và có thể chứa 0,3 mmol peptide/g chất mang.
Hình 3.2.Chất mang Polystyrene/Divinylbenzene
3.1.3.4. Ví dụ:
Để tổng hợp oxytocin (hình 2.9), chất bảo vệ nhóm N-amino được sử dụng là 9-fluorenylmethoxy carbonyl (Fmoc), chất mang rắn là nhựa 2-chlorotrityl- chloride trong dung môi diisopropyl carbodiimide/1-hydroxy benzotriazole (DIC/HOBt). Các bước tiến hành tương tự nguyên tắc đã nêu ở trên với trình tự các amino acid được gắn lần lượt là glycine, leucine, praline, cysteine, asparagines,
glutamine, isoleucine, tyrosine và cuối cùng là cysteine. Ở mỗi giai đoạn, chất bảo vệ Fmoc được tháo ra khi tiến hành xử lý với dung dịch dimethyl formamide (DMF) chứa 20% piperidine trong 30 phút.
Cuối quá trình, chất mang được tách ra bằng cách xử lý với hỗn hợp trifluoroacetic acid/ 1,2-ethanedithiol/ triethylsilane/ anisole/ nước (90:5:2:2:1, v/v), tỉ lệ 15 mL/g chất mang gắn peptide trong vòng 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Hình thành cầu nối disulfide giữa 2 amino acid cysteine ở vị trí 4 và 9 bằng cách oxi hoá nhờ dung dịch dimethyl sulfoxid (DMSO) 25%. Phản ứng này tiến hành trong vòng 24-36 giờ ở nhiệt độ phòng.
Tiến hành xử lý sơ bộ dung dịch bằng phương pháp sắc ký lọc gel với pha tĩnh là Sephadex G-15 (1 loại gel dextran) và pha động là acetic acid. Sau đó sử dụng phương pháp sắc kí lỏng pha đảo với pha động là acetonitrile/nước, pha tĩnh là Lichrosorb C18 (5 m, 250 x 8 mm), detector UV ở bước sóng 254 nm để hoàn tất quá trình tinh sạch oxytocin.
Bằng phương pháp khối phổ, người ta xác nhận sản phẩm thu được cuối cùng có độ tinh sạch > 98%.
Ưu điểm của phương pháp SPPS so với phương pháp tổng hợp trong dung dịch: - Trong quá trình tổng hợp ta không phải thực hiện việc tách và làm sạch các
sản phẩm trung gian rất tốn thời gian như khi làm trong dung dịch. Ở phương pháp này, sản phẩm của phản ứng được giữ lại trên chất mang rắn, những chất tham gia phản ứng còn dư hoặc sản phẩm phụ sẽ được loại bỏ bằng cách lọc.
- Chu kì sản xuất ngắn hơn, năng suất cao hơn.
Nhược điểm của phương pháp SPPS:
- Để có thể có phản ứng xảy ra hoàn toàn thì cần có một lượng lớn các amino acid mỗi loại.
- Vẫn có thể xảy ra các phản ứng không mong muốn (bởi các nhóm chức khác trong mạch của amino acid) trong quá trình hoạt hóa, kết nối, tháo các chất bảo vệ.
- Việc theo dõi tiến trình phản ứng và phân tích xem phản ứng đã hoàn toàn chưa thì rất khó thực hiện.
- Sự trương phồng (swelling) của polymer và sự khuếch tán của các chất phản ứng trong quá trình tổng hợp là điều hết sức quan trọng.
- Điều kiện phản ứng để giải phóng peptide khỏi polymer có thể gây phá hủy sản phẩm.
- Có thể xảy ra hiện tượng ráp mạch không đúng như sau:
Điều này xảy ra khi có sự acyl hóa không hoàn toàn, việc loại các nhóm bảo vệ không hoàn toàn hoặc có một vài amino acid thành phần không được ráp vào mạch. Việc tách các sản phẩm không mong muốn này tốn nhiều thời gian, công sức, do đó cần có biện pháp phòng tránh những hiện tượng này xảy ra.