CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC
3.3.1.3. Lập ngân hàng c-DNA:
Trong thực tế, phương pháp tạo gene từ các mRNA thông tin của chúng được sử dụng rộng rãi. Phương pháp này dựa vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase. Enzyme này có tên gọi đúng nghĩa là DNA-polymerase phụ thuộc RNA (RNA-dependent DNA-polymerase) lần đầu tiên được phát hiện khi nghiên cứu sao chép RNA của retrovirus gây ung thư. Nó có khả năng tổng hợp nên DNA một mạch được gọi là c-DNA (complementary DNA) từ khuôn mRNA hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hóa học. Nhờ enzyme này có thể tổng hợp hầu như bất cứ gene riêng biệt nào miễn có mặt mRNA của gene đó. Các c-DNA mạch đơn có thể được biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là c-DNA kép (c-DNA duplex). Đoạn cDNA-kép được gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng c-DNA.
Hình 3.3.Sơ đồ tạo c-DNA từ mRNA
Để thu nhận mRNA, ta cần chọn mô, cơ quan có sự hiện diện của mRNA mục tiêu, đồng hóa chúng trong dung dịch có chất ức chế Rnase rồi tách riêng mRNA bằng sắc ký cột oligo(dT) cellulose.
Các dòng DNA của bộ gene là những đoạn ngẫu nhiên của tất cả các trình tự nucleotide dọc theo DNA của sinh vật và hầu như không phụ thuộc vào loại tế bào nào dùng để lấy DNA. Ngược lại, các dòng c-DNA chỉ chứa những đoạn gene đã được phiên mã ra mRNA và vì tế bào của các mô đã được biệt hóa sẽ có các loại mRNA khác nhau nên ngân hàng c-DNA nhận được sẽ phụ thuộc vào kiểu tế bào được sử dụng.
Việc sử dụng ngân hàng c-DNA sẽ có nhiều ưu thế:
Các dòng c-DNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene. Nhiều gene ở
Eukaryote là gián đoạn, có chứa nhiều intron không mã hóa. Sau quá trình cắt tiền mRNA và nối lại, các đoạn intron bị loại và mRNA trưởng thành có trình tự mã hóa liên tục được tạo thành. c-DNA được tạo ra từ khuôn mRNA trưởng
thành nên các dòng c-DNA có thể tổng hợp protein cần thiết với số lượng lớn như mong muốn.
Nhiều protein được tổng hợp với số lượng lớn do những tế bào chuyên hóa. Như vậy, trong các tế bào này, mRNA của “protein giàu” đó sẽ có tỉ lệ cao và ngân hàng c-DNA được tạo ra từ các tế bào này sẽ có nhiều c-DNA mã hóa cho các protein tương ứng. Sự dồi dào cDNA một vài loại nào đó làm giảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ ngân hàng gen. Ví dụ, hemoglobine được tạo ra với số lượng lớn ở hồng cầu, các mRNA globine có tỉ lệ cao, nên các gene globine thuộc số những gene đầu tiên được tạo dòng.