Ch-ơng 2: đối t-ợng và ph-ơng pháp nghiên cứu
2.1.2.Các nghiên cứu đánh giá chất l-ợng mảnh ghép
Mảnh ghép sau khi đ-ợc thu nhận, xử lý và bảo quản theo quy trình, tr-ớc khi sử dụng cho phẫu thuật thì có nhiều câu hỏi đ-ợc quan tâm là: Liệu mảnh ghép có liền đ-ợc không hay bị thải loại không? Mảnh ghép có bị thay đổi cấu trúc hình thái từ đó ảnh h-ởng đến các đặc điểm sinh cơ học của mảnh ghép cần cho phẫu thuật hay không? Mảnh ghép có đảm bảo vấn đề vô khuẩn không? Và để trả lời các câu hỏi này, chúng tôi tiến hành 3 nghiên cứu căn bản là:
- Nghiên cứu thực nghiệm ghép gân đồng loại trên thỏ
- Nghiên cứu đánh giá biến đổi siêu cấu trúc của mảnh ghép sau xử lý và bảo quản
- Nghiên cứu cấy khuẩn th-ờng quy mảnh ghép
2.1.2.1. Nghiên cứu ghép gân đồng loại trên thỏ
* Đối t-ợng nghiên cứu: 20 con thỏ đực, khỏe mạnh, giống nội địa, khoảng 3
tháng tuổi, cân nặng từ 1,8 - 2 kg, nguồn gốc từ trung tâm giống dê và thỏ Sơn Tây. 8 con đ-ợc dùng để lấy gân nhằm mục đích ghép lại, 10 con đ-ợc sử dụng cho phẫu thuật ghép gân đồng loại, 2 con đ-ợc ghép gân tự thân để đối chứng.
* Ph-ơng pháp nghiên cứu:
+ Lấy gân vùng gót thà, b°o qu°n theo quy trệnh “ Thu nhận, xừ lỹ v¯ b°o qu°n mô gân” cða Labô B°o qu°n Mô: 8 con thỏ đ-ợc giết bằng cách tiêm
không khí vào mạch máu, sau đó thực hiện phẫu thuật lấy gân vùng gót của thỏ và xử lý gân theo quy trình thu nhận, xử lý và bảo quản mô gân ở ng-ời, bảo quản lạnh sâu âm 85oC của Labô Bảo quản Mô, Bộ Môn Mô Học – Phôi Thai Học, Tr-ờng Đại Học Y Hà Nội.
+ Phẫu thuật trong điều kiện vô trùng: Về mặt phẫu thuật, chúng tôi sử dụng mô hình thực nghiệm ghép gân trên thỏ của tác giả Hideo Kawakami có cải tiến.
Hình 2.3: Mô hình thực nghiệm phẫu thuật trên thỏ theo Hideo Kawakami có cải tiến (hình bên phải). Bên trái là mô hình thực nghiệm nguyên mẫu của
Hình 2.4: Minh họa vị trí lấy gân và vị trí khoan tạo đ-ờng hầm trên thỏ[112]
Trong mô hình thực nghiệm phẫu thuật của Kawakami, hai đ-ờng hầm đ-ợc tạo ra ở x-ơng đùi và x-ơng chầy và mảnh ghép đ-ợc cố định ở cả hai đ-ờng hầm. Chúng tôi chỉ cố định mảnh ghép trong đ-ờng hầm x-ơng đùi còn phần ngoại vi đ-ợc khâu vùi trong tổ chức d-ới da của thỏ.
Thỏ đ-ợc gây mê toàn thân bằng ête. Rạch da, tách cơ vào x-ơng đùi thỏ hai bên, xác định vị trí tạo đ-ờng hầm ở vùng đầu d-ới x-ơng đùi. Khoan tạo đ-ờng hầm vùng đầu d-ới x-ơng đùi sau 2 bên của thỏ, với đ-ờng kính 3,5 mm, sâu 6mm. Mảnh gân thỏ đã đ-ợc xử lý, bảo quản có kích th-ớc 3x10mm, sẽ đ-ợc đặt vào đ-ờng hầm và cố định lại với 1 vit kim loại, đ-ờng kính 2,5 mm dài 6mm. Phần còn lại của mảnh ghép, dài khoảng 4mm đ-ợc khâu cố định vào tổ chức d-ới da của thỏ. Đóng kín vết mổ.
Hình 2.5: Mảnh ghép gân thỏ đồng loại sau khi đ-ợc bảo quản, đang đ-ợc xử lý để ghép lại vào x-ơng đùi thỏ
Nh- vậy, với 10 con thỏ, chúng tôi tạo đ-ợc 20 vị trí ghép mảnh ghép.
Hai con thỏ còn lại đ-ợc tiến hành ghép bằng mảnh ghép tự thân, lấy từ chân sau bên trái ghép sang chân sau bên phải trong cùng 1 cuộc phẫu thuật với quy trình phẫu thuật nh- trên
+ Theo dõi sau mổ; Sau mổ thỏ đ-ợc nuôi riêng trong chuồng đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn thông th-ờng. Đ-ợc theo dõi tình trạng toàn thân, nhiệt độ, tại chỗ vết th-ơng.
+ Đánh giá kết quả sau 4 tuần và 8 tuần: Sau thời gian gian lần l-ợt là 4 tuần và 8 tuần, năm con thỏ của nhóm ghép đồng loại và 1 con thỏ của nhóm ghép tự thân đ-ợc gây chết bằng cách tiêm khí vào tĩnh mạch tai thỏ. Đánh giá về đại thể tại vị trí mổ, từ ngoài vào trong: mô da, mô d-ới da, cơ, màng x-ơng, khớp gối của thỏ. Sau đó, phần đầu d-ới x-ơng đùi đ-ợc cắt ra khỏi cơ thể, đ-ợc khử Canxi x-ơng bằng dung dịch acid formic 30%, đúc khối nến và cắt lát tiêu bản mỏng 7 micromet vuông góc với trục của đ-ờng hầm. Mỗi vị trí ghép làm 5 tiêu bản nghiên cứu. Các tiêu bản đ-ợc nhuộm HE và đánh giá về vi thể d-ới kính hiển vi quang học vật kính 10 và 40[6].
2.1.2.2. Nghiên cứu tổn th-ơng siêu cấu trúc mảnh ghép * Đối t-ợng nghiên cứu:
-
nh nhưn
n qua.
* Ph-ơng pháp nghiên cứu:
t:
+ Rửa cỏc mẫu gõn cú kớch thước khoảng 5mm x 5mm bằng nước cất 2 lần, mỗi lần 5 phỳt. Sau đú mẫu đ ược xử lý bằng cồn Ethylic và
cồn T-butyl và đ ược làm khụ và gắn lờn đ ế mang mẫu của kớnh hiển vi điện tử quột.
+ Mạ phủ mẫu bằng vàng trờn mỏy JFC-1200 của hóng JEOL Nhật Bản và nghiờn cứu mẫu trờn kớnh hiển vi điện tử quột JSM-5410LV của hóng JEOL Nhật Bản tại phũng hiển vi điện tử, khoa Hỡnh thỏi, Viện 69, Bộ Tư lệnh Lăng.
n qua:
Cỏc mẫu gõn đ ược rửa trong nước cất 2 lần, mỗi lần 10 phỳt. Tiếp theo, pha thành cỏc mẫu nhỏ cú kớch thước khoảng 1mm x 1mm x1mm. Sau đú tất cả cỏc mẫu đ ược xử lớ theo quy trỡnh với cỏc dung dị ch nước cất, cacodylate, axit osmic, cồn ethylic và propylen oxide.
+ Đỳc mẫu trong epon bằng khuụn đỳc, đ ể mẫu đó đỳc trong tủ ấm 370C trong 24 giờ; 600C trong 48 giờ.
+ Cắt mẫu trờn mỏy Ultramicrotome LKB4, đ ộ dày lỏt cắt 50 nm. + Đặt cỏc lỏt cắt trờn lưới đ ồng.
+ Nghiờn cứu mẫu trờn kớnh hiển vi điện tử truyền qua JEOL 1010 tại Viện Vệ sinh dị ch tễ Trung ương.
2.1.2.3. Nghiên cứu cấy khuẩn th-ờng quy của quy trình * Đối t-ợng nghiên cứu:
nh.
* Ph-ơng pháp nghiên cứu
ng quy theo nh như sau:
n. t tăm bụn
37o y.
n.
a hai tăm bụng.