Trong quá trình sắc ký, nếu ta nạp vào cột tách một thể tích mẫu là VS mL, thì l−ợng chất phân tích i đ−ợc nạp vào cột tách đó sẽ là :
Qi = VS . CiS (2.40)
Nh− thế nồng độ cực đại của chất tan i đ−ợc rửa giải ra ứng với thời gian l−u tRi sẽ là :
Qi
Cimax = --- (2.41) ( 2.π ).(∂vi )1/2
Trong đó ∂vi là độ lệch chuẩn theo thể tích của chất tan Xi (chất phân tích). (a) (b)
Hình 2.5. Quan hệ giữa tín hiệu nền và giới hạn phát hiện
(a)- Dạng píc sắc ký chất. (b)-Dạng tin hiệu nền
Đồng thời biểu thức này cũng cho ta thấy, nồng độ cực đại của chất tan đ−ợc rửa giải ra là tỷ lệ nghịch với độ lệch chuẩn (∂vi)1/2. Nghĩa là khi độ lệch chuẩn giảm, thì giá trị Ci,max sẽ tăng; tức là chất tan ít bị pha loãng trong quá trình sắc ký, kể từ lúc nó đ−ợc nạp vào ở đầu cột sắc ký cho đến lúc nó đ−ợc rửa giải ra khỏi cột sắc kí. Đó chính là điều mà trong thực tế chúng ta luôn luôn mong muốn. Bởi vì yếu tố pha loãng lớn sẽ làm doãng pic sắc kí nhiều và điều này sẽ ảnh h−ởng đến khả năng tách của các chất, vì khi đó giá trị Hef lớn.
Mặt khác, nếu gọi Vmax mL là thể tích rửa giải của pha động ứng với thời
điểm nồng độ Cmax của chất phân tích đ−ợc rửa giải ra thì chúng ta có:
Co Nef
Ci,max = --- . --- (2.42) Vmax 2. π
Trong đó: Nef là số đĩa hiệu dụng của cột tách; Co là nồng độ của chất tan (tính theo mol/L ) đ−ợc nạp vào vòng mẫu.
Còn ứng với thể tích rửa giải Vx mL bất kỳ của pha động rửa giải, thì nồng độ chất tan tại thời điểm tX nào đó sẽ là:
Nef (Vmax - Vx ) 2
CVx = Ci,max . exp (- --- ⎨ ---⎬ ) (2.43) 2 ( Vmax . Vx )2
Đây là biểu thức để tính nồng độ của chất Xi đ−ợc rửa giải ra tại một thời điểm tX bất kỳ nào của píc sắc ký.
Tất nhiên, nồng độ chất tan phân bố trong pha động và trong pha tĩnh là tuân theo qui luật phân bố Lăngmur tuyến tính và cả không tuyến tính, tuỳ nồng độ của nó là lớn hay nhỏ (hình 2.6). ở đây sự phân bố xẩy ra theo ba dạng, tuỳ thuộc nào nồng độ của chất phân tích đ−ợc nạp vào cột tách:
Hình 2.6. Phân bố nồng độ chất tan
Trong hình này:
Đ−ờng L: Phân bố tuyến tính và pic sắc ký cân đối. Đ−ờng NL1: Phân bố không tuyến tính ( dạng lõm ),
Đ−ờng NL2: Phân bố không tuyến tính ( dạng lồi ),
Trong 2 tr−ờng hợp NL1 và NL2 píc sắc ký bị doãng phía tr−ớc ( NL1) và phía sau ( NL2). Nồng độ chất càng lớn thì mức độ doãng pic càng nhiều. Tức là độ rộng píc sắc ký tăng và chiều cao Hef sẽ tăng ( tức là số đĩa Nef càng giảm ).
Lý thuyết và thực nghiệm chỉ ra rằng:
Kiểu đẳng nhiệt tuyến tính ( đ−ờng L ). Tr−ờng hợp này là hiếm có, đó là tr−ờng hợp lý t−ởng và trong thực tế chỉ có đ−ợc ở vùng nồng độ chất tan rất nhỏ. Trong tr−ờng hợp này thì ki’ = q.Ki. Điều này có nghĩa là hệ số phân bố
và tỷ số pha q ( q = Vs/Vm). Hay nói khác đi là hệ số dung tích không phụ thuộc vào nồng độ và trong tr−ờng hợp này pic sắc ký có hai nhánh hai bên là hoàn toàn cân đối nhau. Trong phân tích nên dùng vùng nồng độ nhỏ này để có đ−ợc sự tách là tốt nhất và các pic sắc ký gọn đẹp.
Kiểu không tuyến tính. Ng−ợc lại, trong thực tế th−ờng xảy ra nh− trong hai đ−ờng phân bố NL1 và NL2. Các tr−ờng hợp này pic sắc ký sẽ không cân đối, và mức độ không cân đối là phụ thuộc vào từng chất tan, nồng độ của nó và cũng nh− điều kiện sắc ký đã đ−ợc chọn.
Chính vì thế, muốn có hiệu quả tách tốt nhất, một trong các điều kiện cần thiết là không nên nạp l−ợng mẫu lớn vào cột tăch sắc ký, để đảm bảo sự phân bố chất trong hệ pha tuân theo gần nh− LăngMua tuyến tính.