D. PHA Tĩnh TRÊN Nền Mạch CARBON
6. Phải phù hợp với loại detector dùng để phất hiện các chất phân tích, không làm h− hại đến flowcell của detector Ví dụ dùng loại detector UV hay UV-
làm h− hại đến flowcell của detector. Ví dụ dùng loại detector UV hay UV- VIS thì pha động phải trong suốt trong các vùng phổ đó, hay dùng detector huỳnh quang, thì pha động phải không có tính huỳnh quang .v.v.
7.Điều kiện cuối cùng là pha động đó phải có tính chất kinh tế, không hiếm, không quá đắt. Tất nhiên yếu tố này trong sắc ký điều chế thì có ý nghĩa rất lớn, nh−ng trong phân tích, trong không ít tr−ờng hợp ta phải chấp nhận pha động đắt tiền để đảm bảo kết quả phân tích chính xác, theo yêu cầu đặt ra, đặc biệt là việc phân tích l−ợng vết bên cạnh một l−ợng lớn chất khác.
Đó là các yêu cầu cần thiết đối với một hệ pha động trong kỹ thuật tách HPLC cho sự tách và phân tích một hỗn hợp mẫu nhất định. Tất nhiên các điều kiện đó cần đ−ợc xem xét cụ thể trong mỗi tr−ờng hợp của hỗn hợp mẫu phân tích, để xem có thể bỏ qua đ−ợc yếu tố nào, và từ đó chọn một pha động tốt nhất cho đối t−ợng nghiên cứu.
Với hệ hấp phụ pha th−ờng (NP-HPLC). Trong sắc ký hấp phụ pha th−ờng, pha tĩnh th−ờng là các Silica trần, nó có bề mặt phân cực, pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực kỵ n−ớc. Nghĩa là n−ớc không tan đ−ợc vào pha động đó. Ví dụ n-hexane, n-heptane, benzen, chloroform, tetrachlorocarbon, v.v. Nó là những dung môi không phân cực hay ít phân cực, hay hỗn hợp của các dung môi đó trong những tỷ lệ nhất định. Trong quá trình sắc ký để cho quá trình tách ổn định, ng−ời ta th−ờng phải bão hoà pha động tr−ớc khi chạy sắc ký bằng n−ớc. Nếu không thì ảnh h−ởng của hàm l−ợng H2O đến thời gian l−u của chất mẫu là rất rõ rệt và sự tách khó lặp lại ( hình 2.21a). Với cách bão hoà n−ớc tr−ớc, ng−ời ta thu đ−ợc kết quả tốt hơn, và sự tách ổn định hơn. Hình 2.22 là một ví dụ về sự thêm n−ớc vào pha động và ảnh h−ởng của nó đến hệ số dung tích ki’ và chiều cao đĩa H nh− thế nào. Nh−ng dù sao đó cũng là một nh−ợc điểm của hệ pha th−ờng ( NP-HPLC ). Do vậy hệ pha NP-HPLC không đ−ợc ứng dụng phổ biến và vạn năng nh− hệ pha ng−ợc ( RP-HPLC ).
Với hệ hấp phụ pha ng−ợc (RP-HPLC). Trong sắc ký hấp phụ pha ng−ợc (RP-HPLC), pha tĩnh th−ờng là các Silica đã đ−ợc alkyl hoá, nó là không phân cực, pha động là hệ dung môi phân cực, nó là những dung môi hữu cơ tan đ−ợc tốt trong n−ớc, và trong rất nhiều tr−ờng hợp, thì n−ớc lại là một thành phần chính của pha động. Tiêu biểu và đ−ợc dùng khá phổ biến trong loại hệ pha ng−ợc là các dung môi methanol, axetônitril, tetrhydrofuran hay hỗn hợp của methanol với n−ớc, axetônitril với n−ớc, hay có thêm các chất tạo phức, chất điện ly, chất đệm pH,.. Nói chung các dung môi để pha chế pha động cho hệ pha ng−ợc là n−ớc cất, các alcon, các axetôn có mạch carbon ngắn, một số axit hay bazơ hữu cơ , một vài amin hay aminôaxit tan tốt trong n−ớc.
thời gian l−u, ti (phút) t
Hình 2.20A. ảnh h−ởng của pha động đến kết quả tách
(a): MeOH/H2O : 50/50 (V/V). (b): THF/H2O : 30/70 (V/V).
Cột tách: 150 x 4,6 mm, Hypersil ODS 5àm. UV-Detector, 254 nm. F =1 mL/phút. Chất tan: 1-p.nitrôphenol, 2-dinitrobenen, 3-Nitrobenen, 4-Metyl-benzôat.
thời gian l−u, ti (phút) t
Hình 2.20b. ảnh h−ởng của tốc độ pha động đến kết quả tách
Tốc độ pha động: (a): F = 0,80 mL/phút. (b): F = 2 mL/phut.
Mẫu: Hỗn hợp các Nuclêôtides: AMP(1), ADP(2), ATP(3), GMP(4), GDP(5), và GTP(6). Pha động: Dung dịch n−ớc (KH2PPO4: 0,015 - 0,25 M)/ KCL 2,2 M.
Hình 2.21a. ảnh h−ởng của hàm l−ợng n−ớc trong MP đến thời gian l−u
của hệ pha NP-HPLC. Tr−ờng hợp c là tốt nhất
Hình 2.21b. ảnh h−ởng của hàm l−ợng n−ớc đến H và ki’
Chính nhờ có đặc tính trên, cho nên hệ RP-HPLC đ−ợc sử dụng rất phổ biến để tách nhiều loại hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, từ các chất không phân cực đến phân cực và kể cả chất có cấu tạo và liên kết iôn, nh− việc tách các axít, bazơ, các iôn kim loại trong sác ký cặp iôn.
Trong hệ pha này, thành phần của pha động cũng ảnh h−ởng rõ rệt đến kết quả tách sắc ký. Hình 2.23 là một ví dụ về vấn đề này, ở đây ảnh h−ởng của thành phần pha động là làm thay đổi thời gian l−u của chất tan, độ phân giải của hệ pha và chiều cao của píc sắc ký. Song chính do tính chất này mà ng−ời ta chọn các pha động khác nhau, sẽ cho các điều kiện tách thích hợp cho sự tách của các hỗn hợp mẫu có thành phần khác nhau.
Trong hệ RP-HPLC, so với các chất hữu cơ, n−ớc là một dung môi phân cực hơn. Do đó sự thêm n−ớc vào dung môi hữu cơ, là để tạo ra một pha động phân cực hơn dung môi hữu cơ nguyên một mình nó, mà lại kém phân cực hơn n−ớc. Nghĩa là pha động này có độ phân cực nằm giữa n−ớc và dung môi hữu cơ đó. Ví dụ thêm n−ớc vào methanol sẽ đ−ợc một pha động có độ phân cực lớn hơn methanol hay ethanol, nh−ng lại nhỏ hơn n−ớc. Tất nhiên độ phân cực lớn hơn bao nhiêu là phụ thuộc vào hàm l−ợng n−ớc đ−ợc thêm vào. Nghĩa là ta tạo ra đ−ợc một pha động có độ phân cực nằm giữa độ phân cực của hai dung môi đơn ban đầu. Chính tính chất này làm cho hệ pha RP-HPLC có tính linh động cao và tạo điệu kiện tốt cho sự tách sắc ký.
Ngoài các dung môi chính nh− đã nêu ở trên, trong thành phần pha động của nhiều tr−ờng hợp tách với hệ pha ng−ợc, còn có thêm:
y Chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký,
y Chất tạo phức để tạo ra sự rửa giải chọn lọc, và sự tách tốt hơn,
y Chất điện ly, chất tạo iôn cặp trong sắc ký cặp iôn, để tạo điều kiện cho một cơ chế sắc ký xẩy ra tốt, ...
Hình 2.22b. Mối quan hệ giữa Ki ( logKi)và nồng độ MP ( logCMP)
thời gian l−u, t (phút) t
Hình 2.23a. Về ảnh h−ởng thành phần pha động
Điều kiện: Detector UV,210 nm. Pha tĩnh: ShimPack ODS, 7 àm, 200.4 mm.
Pha động: MeOH/H2O với tỷ lệ: 90/10, 80/20, 60/40, 50/50. F =1,00 mL/phút. Chất PT: Metyl (1), Ethyl (2), n-Propyl (3), và n-Buthylparaben (4).
thời gian l−u, ti (phút) t
Hình 2.23b. ảnh h−ởng của thành phần pha động đến kết quả tách
Pha tĩnh : LiChrosorb RP-18, 10 àm, kích th−ớc cột 250 x 4 mm. Detector: UV-Spectrophotometer, 254 nm.
Pha động: H2O/MeOH tỷ lệ: (a): 75/25, (b): 50/50 và (c): 15/85. Chất tan: 1-Naphthalen, 2-Anthracen, 3-Pyren và 4-Benzen-anthracen.
Đặc biệt là trong sự tách của các amin, aminoaxit, các axit hữu cơ, các nucleobazide, các iôn kim loại cũng nh− các aniôn, thì những chất phụ trợ này trong pha động, nếu chọn đ−ợc thành phần phù hợp thì chúng cũng đóng góp rất tốt cho kết quả tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Hình 2.24 là một ví dụ về ảnh h−ởng của pH pha động đến hệ số dung tích ki’ của các chất tan.
Với sắc ký ion. Trong sắc ký trao đổi iôn ( IEx-HPLC ) thì pha động là dung dịch n−ớc của các axit, hay bazơ, hoặc là dung dịch n−ớc của các muối kim loại kiềm, kiềm thổ, có chứa chất đệm pH, chất cho iôn tạo cặp, chất tạo phức. Ví dụ để rửa giải các iôn kim loại kiềm và kiềm thổ ra khỏi cột tách chứa pha tĩnh Dowex50-8, ng−ời ta dùng dung dịch n−ớc của NH4CH3COO nồng độ 1 M và để rửa giải các iôn Cu(II), Pb(II), Zn(II), Co(II), Ni(II), ng−ời ta dùng dung dịch axit HNO3 2,5M. Dung dịch n−ớc của EDTA 0,04M đến 0,1M có chứa hệ đệm axetat pH=4,6 để rửa giải các đất hiếm. Trong loại sắc ký này, đặc biệt là sự tách các iôn kim loại chuyển tiếp, các nguyên tố đất hiếm, thì pH của pha động và chất tạo phức có ý nghĩa rất lớn trong quá trình sắc ký .
Thuộc nhóm sắc ký iôn, ngoài sắc ký trao đổi cation và anion, còn có sắc ký cặp iôn. Trong sắc ký cặp iôn, pha động vẫn dùng dung môi n−ớc và methanol là dung môi chính. Thêm vào đó là chất chứa iôn tạo cặp, chất đệm pH, chất tạo phức. Ví dụ, khi tách các nguyên tố đất hiếm bằng sắc ký cặp iôn trên cột pha tĩnh Hypersil ODS ( C18 ) thì pha động là dung dịch n−ớc có chứa chất tạo phức α-HIBA, chất đệm pH là muối NH4CH3COO, chất cho iôn tạo cặp là SDS ( Natri Dodecyl Sunfat ). Hình 2.25 là sắc đồ của sự tách các nguyên tố đất hiếm (NTĐH) theo loại sắc ký cặp ion.
Giá trị pH của pha động, MP t
Hình 2.24. ảnh h−ởng pH của pha động đến hệ số dung tích ki’
Bảng 2.6. ảnh h−ởng của thành phần pha động đến thời gian l−u tRi
Pha tĩnh: Zorbax C8. % àm. Pha động: MeOH/H2O, tốc độ: 1,8 mL/phút. Chất tan: Phenol (A), Benzaldehyde (B), Nitrobenen (C), Metylbenzôat (D). No %NaOH Thời gian l−u giữ tR (phút)
của các chất Kết quả Tách sắc ký A B C D 1 25 10,00 22,00 43,00 88,10 tách tốt 2 45 4,20 6,80 10,10 17,20 tách tốt 3 65 2,30 3,00 3,80 4,80 tách tốt 4 80 1,70 1,86 2,10 2,17 không tốt
Sắc ký chiết. Khác với sắc ký trao đổi iôn, trong sắc ký chiết ( LLC ) , pha động cũng có hai loại: −a n−ớc và kỵ n−ớc. Loại kỵ n−ớc là đối với sắc kí chiết pha th−ờng, ở đây pha tĩnh cũng kỵ n−ớc, còn pha động cũng là những chất hữu cơ kỵ n−ớc. Nó có thể là một dung môi hữu cơ, hay là hỗn hợp của hai hoặc ba dung môi hữu cơ trộn với nhau. Ví dụ nh− chlorôform, tetrachlorôcarbon, benzen, ethylaxetat, hay hỗn hợp của các chất đó với nhau theo những tỷ lệ nhất định. Ng−ợc lại dối với sắc ký chiết pha ng−ợc thì pha động lại là các dung môi phân cực, hay là dung dịch axit hay bazơ loãng có thêm chất đệm pH, muối tan của kim loại kiềm, kiềm thổ, có thể có cả chất tạo phức,...
Thời gian l−u, ti (phút) t
Hình 2.25. Tách các đất hiếm bằng sắc ký cặp iôn
Pha tĩnh: Hypersil ODS, %àm trong cột 250 x 4 mm.
Pha động: Dung dịch α-HIBA có SDS và đệm NH4CH3COO pH 4,6 Gradient α-HIBA 0,02 - 0,25 M trong 30 phút.
Phát hiện: Thuốc thử PAR-Post Col. UV-VIS detector, λ 520 nm. Nguyên tố trong mẫu: (La-Ce-Pr-Nd-Sm-Eu-Gd-Ho-Er-Yb-Lu). Mẫu bơm vào cột: 20 àL của dung dịch 20 àg/mL của mỗi nguyên tố.
tốc độ tuyến tính, u(mm/s.) t
Hình 2.26. Mối quan hệ chiều cao đĩa H với đ−ờng kính hạt pha tĩnh và tốc độ tuyến tính u của pha động và hiệu quả tách
Theo thứ tự từ 1-7 là các cỡ hạt: 5-7-10-15-20-30-35-40 àm dp
Trên đây là khái quát chung về pha động trong kỹ thuật phân tích HPLC. Qua đó, chúng ta thấy có 4 vấn đề cần đ−ợc quan tâm xem xét và chọn cho phù hợp cho mỗi loại hệ pha. Đó là: