X trong dòng pha động đi ra từ cột tách Còn k là hằng số của điều kiện thực nghiệm của detector đã chọn.
định tính và định l−ợng bằng HPLC 4.1 Phân tích định tính theo HPLC
4.2.2. Các ph−ơng pháp định l−ợng 1 Ph−ơng pháp đ−ờng chuẩn
4.2.2.1. Ph−ơng pháp đ−ờng chuẩn
Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian l−u của chất là đại l−ợng đặc tr−ng để định tính ( phát hiện ) các chất. Còn chiều cao của pic sắc ký H hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn ( b=1), thì chúng ta luôn có biểu thức xác định mối quan hệ đó là:
Hi = k1.Ci (a) và Si = k2.Ci (b)
Trong đó:
+ Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i. + Ci là nồng độ của chất ứng với thời gian l−u tRi.
+ Còn k1, k2 là các hằng số thực nghịệm, nó phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký của hệ pha.
Trong hai mối quan hệ này, quan hệ Si - Ci theo biểu thức (b) có vùng tuyến tính rộng hơn quan hệ Hi - Ci theo biểu thức (a). Nh−ng trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic Hi là dễ dàng hơn đo diện tích Si. Vì thế trong phân tích l−ợng nhỏ ( nồng độ nhỏ ) ng−ời ta th−ờng đo chiều cao pic H.
Do đó nguyên tắc của phân tích định l−ợng theo HPLC là, trong một hệ pha và với các điều kiện sắc ký đã chọn ( quy trình phân tích ), để định l−ợng một chất chúng ta phải làm nh− sau:
y Pha chế ( chuẩn bị ) một dẫy mẫu chuẩn của chất phân tích Xi có nồng độ là từ C0, C1, C2, C3, C4, C5 và các mẫu phân tích Cx1, Cx2,... trong cùng điều kiện phù hợp ( bảng 4.1). Với C0 là mẫu trắng.
y Chọn các điều kiện ( quy trình chạy sắc ký ) để chạy sắc ký và ghi sắc đồ của dẫy mẫu chuẩn và các mẫu phân tích.
y Xác định chiều cao H hay diện tích S của pic sắc ký trong tất cả các mẫu chuẩn và mẫu phân tích ( bảng 4.1).
y Dựng đ−ờng chuẩn theo quan hệ Hi - Ci hay Si - Ci ( hình 4.3).
y Sau đó từ các giá trị Hx hay Sx của mẫu phân tích áp vào đ−ờng chuẩn t−ơng ứng chúng ta sẽ phát hiện đ−ợc nồng độ của chất trong các mẫu phân tích đã đ−ợc bơm vào cột tách sắc ký.
Bảng 4.1. Dẫy mẫu chuẩn và mẫu phân tích
Các chất Co C1 C2 C3 C4 C5 Cx
Chất PT Xi (ppm) 0 1 2 3 4 5 Cx Chất khác Nh− nhau
Đo H (cm) H0 H1 H2 H3 H4 H5 HX
Đo S ( cm2) S0 S1 S2 S3 S4 S5 SX
Ph−ơng pháp đ−ờng chuẩn có −u việt là rất thích hợp để xác định hàng loạt một loại mẫu cùng đối t−ợng. Nó đơn giản, nhanh và dễ thực hiện. Hơn nữa trong một quá trình sắc ký, chúng ta có thể xác định ( định l−ợng ) cùng một lúc trong một sắc đồ nhiều chất có trong một mẫu đồng thời. Nh−ng khi mẫu phân tích có thành phần phức tạp, chúng ta không thể pha chế đ−ợc một dẫy mẫu chuẩn phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền, thành phần hoá học và vật lý, thì sẽ bị mắc sai số lớn, do ảnh h−ởng của thành phần mẫu. Nhất là xác định l−ợng vết các chất. Trong tr−ờng hợp này để loại trừ yếu tố Matrix Effect của mẫu, tốt nhất là dùng ph−ơng pháp thêm tiêu chuẩn.
Hi
Nồng độ chất, Ci ( ppm) t
Hình 4.3. Đ−ờng chuẩn phân tích chất Xi , H - C