D. PHA Tĩnh TRÊN Nền Mạch CARBON
6. Nhiệt độ cột tách trong quá trình sắc ký.
2.7. ảnh h−ởng của cấu trúc phân tử chất tan
Cùng với hai yếu tố quyết định kết quả của sự tách là pha tĩnh và pha động, thì cấu trúc của phân tử chất mẫu ( chất phân tích, chất tan ) là yếu tố thứ ba đóng góp vào việc quyết định kết quả tách sắc ký. ở đây các nhóm thế, số nhóm thế, cấu trúc và vị trí của nó trong phân tử chất tan cũng ảnh h−ởng rõ rệt đến sự tách sắc ký trong một hệ pha nhất định. Nghĩa là yếu tố này đóng góp vào việc quyết định thời gian l−u tRi của chất phân tích trong cột sắc ký. Xem xét một cách tổng quát, chúng ta thấy thời gian l−u tRi của một chất tan phụ thuộc vào các yếu tố sau:
+ Loại cấu trúc phân tử của chất tan ( chất mẫu ), + Loại nhóm thế, độ lớn và cấu trúc nhóm thế, + Vị trí nhóm thế trong phân tử chất tan, + Số nhóm thế có trong phân tử chất tan, + Các chất dị tố có trong phân tử chất tan.
Tất cả các yếu tố này ảnh h−ởng đến kết quả tách nh− thế nào là còn có quan hệ chặt chẽ với bản chất của mỗi hệ pha trong những điều kiện thí nghiệm nhất định và tất nhiên cùng một chất tan, những với hệ pha th−ờng (NP-HPLC) và với hệ pha ng−ợc (RP-HPLC) chúng sẽ xử sự hoàn toàn khác nhau. Sự khác nhau này là do bản chất của pha tĩnh và pha động quyết định.
Với sắc ký hấp phụ pha th−ờng ( NP-HPLC): Nói chung trong loại sắc ký này, khả năng của chất tan bị l−u giữ trên pha tĩnh là phụ thuộc rất nhiều vào độ lớn và tính phân cực của phân tử chất tan. Nếu phân tử chất tan có dạng R-X, trong đó R là gốc hữu cơ, còn X là nhóm thế, thì thời gian l−u giữ
tRi của chất tan i trên cột tách theo thứ tự sau đối với nhóm thế X: Nhóm thế alkyl < halogen ( F, Cl, Br. J) < ether < tert-amin < nitril < nitro < ester của
axit hữu cơ < xêton < aldehyde < pri-amine < amid-axit < alkohol < phenol < axit carboxilic < sunfo axit, < ... Nh− vậy chất tan nào có độ phân cực nhỏ nhất trong hỗn hợp mẫu, nó sẽ đ−ợc rửa giải ra tr−ớc tiên, chất nào có độ phân cực lớn nhất sẽ đ−ợc rửa giải ra sau cùng. Ng−ợc lại trong một dãy đồng đẳng, thì thời gian l−u của chất tan là tăng theo khối l−ợng phân tử của chúng. Nghĩa là trong một dẫy đồng đẳng, chất tan nào có phân tử l−ợng nhỏ sẽ đ−ợc rửa giải ra tr−ớc ( hình 2.30 và bảng 2.10 ). Mặt khác khi số nhóm chức trong phân tử chất tan càng nhiều thì thời gian l−u tRi của nó cũng bị tăng theo.
Với sắc ký hấp phụ pha ng−ợc (RP-HPLC): Nói chung ảnh h−ởng của phân tử chất tan đến sự tách trong pha này là ng−ợc lại với pha th−ờng đã nêu ở trên. ở đây ng−ời ta thấy thời gian l−u tRi của chất tan i là tăng khi độ tan của nó trong n−ớc giảm. Điều này có nghĩa là chất tan ít phân cực sẽ bị l−u giữ lâu hơn chất tan phân cực nhiều. Nh− vậy trong hệ pha này, chất tan nào ít phân cực nhất sẽ đ−ợc rửa giải ra sau cùng của quá trình sắc ký. Tác dụng của nhóm chức với thời gian l−u trong tr−ờng hợp của hệ pha ng−ợc tuân theo thứ tự sau: Nhóm Sunfo axit < axit carboxilic < phenol < alkohol < amid axit < ... < hyđrô carbon. Còn trong một dãy đồng đẳng, với hệ pha ng−ợc, thì thời gian l−u tăng theo chiều dài của mạch carbon của nhóm thế, và số nhóm thế. Ví dụ khi tách hỗn hợp của bốn chất nh−: phenol, (CH3)-phenol, 2(CH3)- phenol, và 3(CH3)-phenol ta thấy hệ số dung tích ki’ tăng dần theo số nhóm thế CH3 từ 1 nhóm đến 3 nhóm thế trong hệ pha tĩnh RP-18 và pha động là hỗn hợp MeOH và H2O ( hình2.31 và bảng 2.10 ).
Hình 2.31. Sự liên hệ giữa nhóm thế của chất mẫu và
thời gian l−u hay ki’ trong hệ RP-HPLC.
Tên chất Các nhóm thế R1, R2, R3 ki’ R1 R2 R3 1. Nitrazin -H -C3H7 -CH3 0,60 2. Atrazine -H -C3H7 -C2H5 0,80 3. Propazine -H -C3H7 -C3H7 1,14 4. Trietazine -C2H5 -C2H5 -C2H5 1,77 5. Jpazine -C2H5 -C2H5 -C2H5 2,36
Nh− ví dụ trong hình 2.31 ta thấy, với phenol khi có thêm hai nhóm thế (-OH) thì thời gian l−u giảm, còn khi thêm 1, 2 và 3 nhóm thế -CH3 thì thời gian l−u lại tăng. Cũng t−ơng tự, khi phenol có thêm nhóm thế -C2H5 và - C3H7.
Trên đây chỉ là một ví dụ, tất nhiên trong thực tế là rất đa dạng, và đối với một hệ pha, thì ảnh h−ởng của cấu trúc phân tử chất tan và các nhóm thế là rất khác nhau. Với hệ pha th−ờng và hệ pha ng−ợc, nói chung ảnh h−ởng này là ng−ợc nhau t−ơng tự nh− trong tính chất của hai hệ pha đó. Vì thế trong mỗi loại mẫu, hay mỗi mhóm chất phân tích chúng ta cần phải tiêu chuẩn hoá các điều kiện sắc ký thì mới có đ−ợc kết quả tốt.