Trên nền silica, các hãng đã chế tạo đ−ợc rất nhiều loại SP khác nhau cho kỹ thuật HPLC. ở đây có hai loại silica hấp phụ cho NP-HPLC và RP-HPLC. Đó là các silica trung tính và các silica đã alkyl hoá, Sunfônic hoá, Nitrô hoá, amin hoá hay Xyal hoá, để tạo ra các pha tĩnh (SP) cho sắc ký hấp phụ pha th−ờng, pha ng−ợc, sắc ký trao đổi iôn, sắc ký rây phân tử. Sau đây chúng ta sẽ chỉ điểm qua một vài chất cho mỗi loại.
Silica trung tính: Silica trung tính hay còn gọi là Silica trần. Đây là chất nhồi cột của sắc ký lỏng cao áp hấp phụ pha th−ờng ( NP-HPLC ). Nó có bề mặt phân cực. Loại pha tĩnh này trên bề mặt của nó còn chứa các nhóm -OH (hình 2.13). Đó là các nhóm hoạt động của silica, các nhóm này phân cực và
thuộc nhóm ái n−ớc (−a n−ớc). Ví dụ nh− các LiChrosorb- Si40, -Si60, -Si100, Si1000, Hypersil, àl-Partisil, Micropark-Si, v.v. Loại SP này chủ yếu đ−ợc dùng để tách các chất hay hợp chất không phân cực và ít phân cực. Pha động cho loại pha tĩnh này là những chất hữu cơ không phân cực hay ít phân cực và kị n−ớc. Đó là các dung môi hữu cơ đơn, hay hỗn hợp của hai hay ba dung môi hữu cơ không tan đựợc trong n−ớc, nh− Benzen, toluen, Cloroform, Ethyl axetat, n-Hexan, ...
Với pha tĩnh loại này, n−ớc có ảnh h−ởng rất nhiều đến bề mặt hoạt động sắc ký của chúng, tức là các nhóm -OH ái n−ớc. Các yếu tố này ảnh h−ởng đến độ lặp lại của quá trình tách sắc ký.
Hình 2.11. Cấu trúc xốp của pha tĩnh
+ (a) và (b): Xốp toàn phần, +(c) và (d): Xốp bề mặt
H H
tốc độ u (mm/ph)t
Hình 2.13. Bề mặt hoạt động của pha tĩnh th−ờng, silica trần
Silica đã alkyl hoá: Đây là pha tĩnh của sắc ký hấp phụ pha ng−ợc (RP- HPLC ). Nó đ−ợc điều chế từ các silica trung tính qua việc alkyl hoá các nhóm -OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl- R của mạch carbon thẳng ( -C1, -C8, -C18 ) hay các gốc carbon vòng, nh− nhân phenyl. Nên chất SP loại này có bề mặt không phân cực hay rất ít phân cực. Việc gắn các gốc alkyl vào phân tử silica trung tính có thể trực tiếp, hay qua một nguyên tố trung gian ôxy ( hình 2.14 ). Chính do bị thế mất các nhóm OH, nên bề mặt của SP loại này là không phân cực hay rất ít phân cực. Nên n−ớc không ảnh h−ởng đến bề mặt của nó. Về SP loại này có Hypersil ODS (-C18, Hãng Shandow), LiChrosorb RP8, và RP18 (Hãng Merck), C-18Corasil, Phenyl-Corasil (HãngWhatmann), Các SP loại này là pha tĩnh để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực và có thể cả cho sắc ký cặp iôn. Dung môi cho pha tĩnh loại này là các chất hữu cơ phân cực tan trong n−ớc, nh− methanol, axêtônitril, hay hỗn hợp của các chất này với nhau và với n−ớc theo tỷ lệ nhất định.
Pha tĩnh loại này là kỵ n−ớc, nghĩa là bề mặt hoạt động của nó không bị ảnh h−ởng của các phân tử n−ớc, mà trái lại n−ớc lại là một thành phần của dung môi rửa giải có ý nghĩa thực tế lớn. Sự tách với SP loại này có độ lặp lại tốt. Do đó, hiện nay SP loại này đ−ợc ứng dụng nhiều hơn loại silica trung tính cho việc tách và phân tích của nhiều loại hỗn hợp mẫu khác nhau.
Các silica đã đ−ợc Sunfônic hoá hay Nitrô hoá. Đây là sản phẩm của sự sunfonic hoá hay nitrô hoá các silica trung tính để thay các nhóm -OH trên bề mặt silica trung tính hay nguyên tử Hydro trong gốc alkyl của pha ng−ợc bằng các nhóm -SO3H hay -NO2H. Pha tĩnh loại này thuộc loại sắc ký trao đổi iôn ( Catiôn ). Vì loại nhóm chức -SO3H và -NO2H có iôn H+ có thể trao đổi đ−ợc với các catiôn kim loại khác. Đó là pha tĩnh trao đổi catiôn axit mạnh. Nh−ng nếu ta thay nhóm -OH bằng nhóm -R-COOH thì ta có pha tĩnh trao đổi catiôn axit yếu. Trong thực tế, sau khi tạo đ−ợc các nhóm chức trên, ng−ời ta th−ờng để pha tĩnh này ở dạng muối của iôn kim loại kiềm Na+. Nghĩa là - SO3Na, -NO2Na, -R-COONa, và chính nhóm chức này quyết định bản chất sắc ký của loại pha tĩnh này. Ví dụ về loại này có LiChrosorb KAT (Hãng
Merck );Partisil SCX (Hãng Whatmann ), Hypersil-CEX ( Hãng Shandown ) và nhóm chức của nó là -SO3Na ( xem phụ lục ).
Hình 2.14a. Cấu trúc của pha tĩnh đã alkyl hoá ( loại RP )
Pha tĩnh loại này dùng để tách các chất có cấu tạo iôn, nh− iôn các kim loại và hợp chất của chúng, hay các chất khi tan trong pha động thì phân ly thành iôn ( catiôn và aniôn ), nh− các axit, các bazơ. Pha động của loại sắc ký này là dung dịch n−ớc của các muối, có chứa chất đệm, chất tạo phức, dung dịch axit hay bazơ, hoặc có thể thêm các chất hữu cơ tan trong n−ớc. Hình 2.15 là một ví dụ về cấu tạo phân tử của pha tĩnh trao đổi ion.
Các silica đ−ợc amin hoá. Loại này là những silica trung tính đã đ−ợc thay thế nhóm -OH bằng các nhóm -NH2, -NH, -NR2, -NR3, -CH2, -CH2(OH). Nó là SP của sắc ký trao đổi aniôn, để tách các aniôn trong hợp chất có cấu trúc iôn, hay những chất khi tan trong pha động thì phân ly thành iôn, nh− các bazơ, các axit hữu cơ. Pha động của loại này cũng là dung dịch n−ớc của các muối, chất đệm, dung dịch axit hay bazơ. Thuộc về loại này có LiChrosorb- NH2, LiChrosrb-CN, Nucleosil-5NH2, -N(CH3), -SB-N(CH3)2Cl, Partisil-SAX, Micropark-CN, Hyperasil-APS ( xem phụ lục ).
Đến nay, pha tĩnh trên nền silica đã có hàng trăm chất khác nhau. Nh−ng chỉ thuộc hai loại là silica trung tính và các silica đã bị alkyl hoá, sunfônic hoá, nitrô hoá hay amin hoá các nhóm -OH để thay đổi tính chất của bề mặt hoạt động của nó. Trong đó các silica đã đ−ợc alkyl hoá là đ−ợc sử dụng phổ biến hơn cả, nh− nhóm -C8, -C18. Vì nó có nhiều −u việt và phục vụ đ−ợc cho sự tách cả các chất không phân cực, ít phân cực và phân cực. Mặt khác pha động của nó lại là trên nền dung dịch chứa n−ớc, là dung môi phổ biến và kinh tế có thêm methanol hay acetonitril.
Hình 2.15. Nhóm chức của pha tĩnh trao đổi cation
(a): SP trao đổi ion Axit mạnh. (b): SP trao đổi ion axit yếu. B. PHA Tĩnh TRÊN Nền ÔXIT NHÔM
Trên nền ôxit nhôm của sắc ký hấp phụ cổ điển, ngày nay ng−ời ta cũng đã chế tạo đ−ợc một số chất nhồi cột cho kỹ thuật phân tích HPLC. Nh−ng chủ yếu vẫn chỉ là những chất nhồi của sắc ký hấp phụ pha th−ờng. Bề mặt của loại pha tĩnh này cũng phân cực và có hai trung tâm phân cực khác nhau. Đó là trung tâm axit ( Al+ ) và trung tâm bazơ ( O- ). Nh−ng trung tâm bazơ mạnh hơn trung tâm axit. Vì thế pha tĩnh loại này có tính bazơ yếu ( pH: 8 - 10 ). Do tính có chất này, nên pha tĩnh chế tạo dựa trên nền ôxit nhôm phù hợp cho sự tách hỗn hợp của các axit yếu, nhất là một số chất hữu cơ ít phân cực. Pha tĩnh loại này có bề mặt phân cực, nên cũng ái n−ớc và vì thế, n−ớc cũng ảnh h−ởng đến bề mặt của nó, tức là ảnh h−ởng đến hiệu quả của sự tách sắc kỹ các chất. Nghĩa là nó cũng giống nh− các silica trung tính. Thuộc về loại này có LiChrosorb-AloxT ( Merch ), MicroPark-Al ( Varian ), Perisorb- A5y, -A1Oy ( USA ), Oxid-Al-18 ( Pharmacy. Thuỵ điển).
Dung môi của pha tĩnh loại này cũng là các chất hữu cơ phân tử không phân cực hay ít phân cực, hoặc hỗn hợp của chúng với nhau theo những tỷ lệ phù hợp. Ví dụ: n-Hexan, n-Heptan, Ethyl acetat, Benzen, Chloroform. Nó cũng là các dung mội kỵ n−ớc.
Song hiện nay, trong kỹ thuật HPLC, chất nhồi loại này không đ−ợc dùng nhiều nh− các silica. Vì hầu hết các quá trình tách trên chất nhồi nền silica và nền ôxit nhôm, thì nhiều tr−ờng hợp nền ôxit nhôm cho kết quả không tốt nh−
nền silica. Mặt khác ôxit nhôm (Al2O3) lại có nhiều dạng thù hình, trong đó chỉ có dạng γ mới có tính chất sắc ký tốt.