D. PHA Tĩnh TRÊN Nền Mạch CARBON
6. Nhiệt độ cột tách trong quá trình sắc ký.
2.8. ảnh h−ởng của thể tích mẫu nạp vào cột tách
Nghiên cứu vấn đề này chúng ta thấy rằng, nói chung trong một thể tích mẫu ( VS hay l−ợng mẫu Qi=VS.Ci ) nhất định nhỏ hơn thể tích giới hạn V0 thì khi l−ợng mẫu ( nồng độ chất tan ) đ−ợc nạp vào cột tắch tăng thì chiều cao của píc sắc ký cũng tăng theo tuyến tính. Còn khi l−ợng mẫu nạp vào cột là VS lớn hơn Vo thì lúc này sẩy ra hiện t−ợng là:
y Chiều cao píc sắc ký không tăng tuyến tính với l−ợng mẫu,
y Độ rộng của píc sắc ký lại tăng rõ rệt, khi l−ợng mẫu tăng v−ợt quá giới hạn nào đó nhất định. Do đó ảnh h−ởng rõ rệt đến độ phân giải ( sự tách ) của hai chất cạnh nhau. Đồng thời lúc này thời gian l−u của chất cũng có bị thay dổi chút ít ( lớn hơn ). Hình 2.31 là một ví dụ về vấn đề này.
y Làm tăng chiều cao của đĩa Hef, do đó làm giảm hiệu lực tách ( Nef).
Để làm sáng tỏ vấn đề này chúng ta hãy quan sát ví dụ về sự tách sắc ký trong hình 2.32. ở đây l−ợng mẫu đ−ợc nạp vào cột sắc ký lần l−ợt là V1, V2, V3, Vo ( trong điều kiện là: V1 = 0,25 Vo ; V2 = 0,5 Vo ; V3 = 0,75 Vo, đến khi Vn = 2Vo, 3Vo,..), tốc độ pha động là F = 1,25 mL/phút. Chất mẫu là phenol trong hệ sắc ký pha ng−ợc, pha tĩnh Hypersil ODS 5 àm.. Pha động để rửa giải ở đây là hỗn hợp ( MeOH/H2O) trong tỷ lệ 70/30 (V/V).
L−ợng mẫu (àg/mL) t
Hình 2.32a. Mối quan hệ giữa l−ợng mẫu với H với các ki’ khác nhau
Khi l−ợng mẫu lớn hơn 1 àg/mL, thì chiều cao đĩa Hef tăng rất nhanh. Và khi ki’ càng lớn, thì Hef tăng nhanh hơn.
Thời gian l−u, tRi (phút) t
Hình 2.32b. Mối quan hệ giữa l−ợng mẫu với độ doãng píc sắc kí
V1, V2, V3, V4, V5,.. Là các thể tích mẫu tăng dần
Ta thấy, khi thể tích mẫu lớn hơn V0, thì độ rộng pic tăng nhanh.
Theo kết quả trên hình vẽ này cho ta thấy, khi thể tích mẫu tăng từ V1 đến Vo àL, thì chiều cao của píc sắc ký tăng đều đặn. Nh−ng ở thể tích mẫu V5 = 1,5 Vo, thì chiều cao của píc sắc ký hầu nh− tăng rất ít mà sự mở rộng của píc là rõ ràng hơn. Và nếu ta dùng thể tích V6 = 2Vo để nạp vào cột tách, thì sự mở rộng píc lại càng rõ rệt hơn, đặc biệt là sự mở rộng píc về phía sau ( đẳng nhiệt loại L1 ). Thể tích mẫu Vo t−ơng ứng với l−ợng mẫu Q0 đ−ợc gọi là
phân tích HPLC, ng−ời ta thấy rằng không nên nạp l−ợng mẫu vào cột tách sắc kí bằng thể tích giới hạn V0 mL, mà th−ờng nhỏ hơn một ít, để có đ−ợc hiệu quả tách sắc kí cao nhất. Thông th−ờng l−ợng mẫu Qi nạp vào cột tách tốt nhất là trong khoảng từ 60 đến 80% của Q0 giới hạn, và Q0 = V0.Ci đ−ợc gọi là l−ợng mẫu giới hạn tối đa đ−ợc phép nạp vào cột tách sắc ký. Tức là l−ợng mẫu Qi cần nạp vào cột tách phải thoả mãn điều kiện: Qi≤ Q0.
àg mẫu/1g SP t
Hình 2.32b. Quan hệ giữa l−ợng mẫu và chiều cao pic Hef
(a): Quan hệ giữa l−ợng mẫu và chiều cao đĩa H, hệ số dung tích ki’ (b): Quan hệ giữa thể tích mẫu VS và chiều cao, độ rộng píc