D. PHA Tĩnh TRÊN Nền Mạch CARBON
7.Chuẩn bị mẫu theo cách nào, để có dung dịch mẫu nạp cột tốt, v.v
Trong các loại yếu tố nói trên, loại thứ 4 là các yếu tố thuộc về hệ thống trang bị của kỹ thuật HPLC. Nó gồm có van bơm mẫu và vòng chứa mẫu, hệ thống ống dẫn, detector và các thông số của nó. Ví dụ nếu dùng detector đo phổ hấp thụ phân tử UV-VIS thì các thông số đó là: khe vào, khe ra của chùm sáng, độ nhậy của băng hấp thụ, flowcell, sóng hấp thụ của chất phân tích. Nếu dùng detector huỳnh quang thì chú ý chọn đúng sóng kích và sóng phát xạ huỳnh quang để đo,... Tất cả những yếu tố trên, nếu chúng ta khảo sát và chọn phù hợp nhất cho các chất mẫu thì có nghĩa là đã tiêu chuẩn hoá loại yếu tố này. Tất nhiên ta không thể có đ−ợc điều kiện tối −u cho một hỗn hợp mẫu nhiều chất thuộc các nhóm quá khác nhau về tính chất. Mà đó là những điều kiện dung hoà phù hợp nhất cho tất cả các chất có trong hỗn hợp mẫu, để có đ−ợc kết quả sắc ký khả quan nhất. Nh−ng ở đây cần đ−ợc quan tâm nhất là chọn loại detector nào để phát hiện và đo định l−ợng đ−ợc các chất với hiệu quả tốt. Sau khi chọn đ−ợc các điều kiện trên rồi, thì còn lại là những yếu tố
của pha tĩnh và pha động liên quan và quyết định đến hiệu quả sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Những yếu tố này cũng đã đ−ợc đề cập đến trong các phần nói về pha tĩnh và pha động ở các mục trên. Vì thế ở đây chỉ nhắc lại một cách tóm tắt mà thôi.
Pha tĩnh: Pha tĩnh là các chất để nhồi vào cột sắc ký và nó là một yếu tố quyết định hiệu quả tách của một hỗn hợp chất mẫu. Tuỳ theo bản chất của chất mẫu mà pha tĩnh có thể là loại hấp phụ pha th−ờng (NP-HPLC), hấp phụ pha ng−ợc (RP-HPLC), trao đổi iôn (IEX-HPLC), sao cho để đạt đ−ợc hiệu quả tách tốt nhất. Hiệu quả tách này đ−ợc thể hiện qua độ phân giải Rịj của hai chất mẫu i và j bên cạnh nhau theo pha tĩnh đã chọn. Độ phân giải Rij của hai chất này đ−ợc tính theo công thức sau đây:
ki’ L
Rij = ( rij - 1 ) .--- . ( --- )1/2 (2.60) ( 1 + ki’ ) Hi
Trong đó:
+ rij là hệ số chọn lọc ( rij = ki’/ kj’), + L là chiều dài của cột tách,
+ Hi là chiều cao đĩa lý thuyết của chất i.
Ph−ơng trình trên cho ta thấy, độ phân giải của hai chất i và j là Rij là phụ thuộc vào các thông số của hệ pha là ki’, kj’, L và Hi. Theo công thức trên, nếu cột tách có chiều dài L bằng 25 cm, thì công việc ở đây là phải chọn chất nhồi có kích th−ớc đ−ờng kính hạt thế nào để hai chất mẫu i và j tách đ−ợc hoàn toàn khỏi nhau. Nh− vậy có nghĩa là sau khi chọn đ−ợc loại chất nhồi rồi, chúng ta chọn cỡ hạt (dp) của nó là bao nhiêu cho phù hợp để cột tách có đủ số đĩa cần thiết, tức là thông số Hi để có hiệu quả tách tốt của hai chất i và j. Yếu tố thứ hai có thể thay đổi đ−ợc ở đây là hệ số chọn lọc rij của chất, tức là ki’ và kj’. Việc thay đổi hai tham số này có thể đạt đ−ợc qua việc thay đổi thành phần các dung môi tao ra pha động và nhiệt độ tách.
Pha động: Yếu tố thứ hai quyết định hiệu quả tách trong ký thuật phân tích HPLC là bản chất của các chất tạo thành pha động và thành phần của chúng. Đây là một yếu tố hết sức linh động và dễ dàng thay đổi. Việc này có thể làm đ−ợc nhờ trộn các dung môi khác nhau với các thành phần khác nhau ta sẽ đ−ợc một pha động tốt cho một hỗn hợp chất mẫu với một pha tĩnh đã đ−ợc chọn. Các pha động đã nêu trong bảng 2.10 và 2.11 là những ví dụ về việc nghiên cứu chọn pha động. Ví dụ pha động N2 trong bảng 2.11 cho hiệu quả tách tốt nhất hai chất đã nêu; Vì rij bằng 2,20; Còn pha động N3 cho kết quả tách tồi nhất ( rij bằng 1,05 ). Đó là các ví dụ về sự tách trên pha tĩnh phân cực ( các silica trần ). Ng−ợc lại, nếu chúng ta chọn pha tĩnh là các silica đã đ−ợc alkyl hoá nhóm-OH bằng mạch carbon -C8, -C18, ví dụ nh− các chất
RP-8, RP-18, hypersil-ODS, thì dung môi chính của pha động là acetônitril hay methanol. Còn thành phần B hay C thêm vào th−ờng là n−ớc cất, hay các dung môi hữu cơ phân cực khác tan trong n−ớc. Điều này chúng ta có thể xem trong ví dụ ở hình 2.37 khi dùng pha tĩnh là hypersil-ODS 5àm, pha động gồm methanol và n−ớc, để tách hai chất phenol và nitrô phenol. Ta thấy, nếu pha động chỉ gồm methanol, hay là methanol có thêm 10% n−ớc thì hai chất này không đ−ợc tách. Nh−ng nếu dùng pha động là methanol có chứa 30-35% n−ớc thì hai chất này lại đ−ợc tách hoàn toàn khỏi nhau. ở đây chính việc thay đổi thành phần của pha động đã làm thay đổi rõ rệt hệ số dung tích ki’ của các chất tan và đ−a đến làm cho độ chọn lọc rij tăng. Tức là chọn đ−ợc pha động có lực rửa giải E thích hợp.
Những nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm cho thấy rằng, khi thay đổi thành phần pha động, chúng ta có thể thay đổi đ−ợc hệ số dung tích ki’ của chất từ 2 đến 10 đơn vị, mà vẫn có thể giữ nguyên đ−ợc lực rửa giải E của pha động, hoặc có thể thay đổi không đáng kể. Vì thế ng−ời ta nói, pha động là một yếu tố linh động và rất vạn năng của ký thuât tách HPLC. Ngoài việc thay đổi thành phần của các dung môi tạo ra pha động, chúng ta còn có thể điều chỉnh pH của pha động, thêm vào pha động chất tạo phức, chất hoạt động bề mặt, chất làm chậm, chất điện ly,v.v.. Trong nhiều tr−ờng hợp, những yếu tố này có ảnh h−ởng rõ rệt đến hiệu quả tách của một hỗn hợp mẫu phân tích. Ví dụ với sắc ký trao đổi iôn, thì pH và chất tạo phức có ý nghĩa rất lớn. Yếu tố thứ bảy là công việc chuẩn bị mẫu. Việc này nếu làm không tốt thì đây là một nguồn gây sai rất lớn của kết quả phân tích. Vì ta có thể làm mất chất phân tích có trong mẫu, hay làm nhiễm bẩn thêm vào. Nói chung là phải chọn một kỹ thuật xử lý phù hợp nhất thoả mãn các điều kiện của phân tích và phải xử lý mẫu trong một môi tr−ờng không làm nhiễm bẩn mẫu. Đồng thời cũng phải có tay nghề và kỹ xảo chuẩn bị mẫu. Có nh− thế chúng ta mới có đ−ợc dung dịch mẫu trung thực, để bơm vào hệ thống tách sắc ký, thực hiện quá trình tách và xác định các chất.
Ngoài các yếu tố trên, một yếu tố khác cũng có ảnh h−ởng đến kết quả tách là nhiệt độ. Trong một số tr−ờng hợp, khi tăng nhiệt độ, sẽ làm cho hiệu quả tách tốt hơn. Tất nhiên việc tăng nhiệt độ cột tách cũng có giới hạn. Thông th−ờng cao nhất cũng chỉ đến 75oC. Vì nhiệt độ cao hơn sẽ ảnh h−ởng đến độ bền của pha tĩnh cũng nh− pha động.
Nói tóm lại, tối −u hoá các điều kiện trong kỹ thuật phân tích HPLC để tách một hỗn hợp mẫu nhất định là phải giải quyết những công việc, hay các vấn đề cụ thể cần thiết nh− sau, để có đ−ợc một quy trình tách và phân tích thích hợp cho một loại hỗn hợp mẫu của chúng ta, nhằm mục đích thu đ−ợc kết quả sắc ký và phân tích tốt nhất :