C X= (∆X.HX )/( Htch H X) (4.3)
2. Sự phát triển HPLC lên UPLC 1 Pha tĩnh ( chất nhồi cột )
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ), muốn có sự tách tốt một hỗn hợp các chất, nhất là hỗn hợp các chất khó tách, thì phải có điều kiện về mối quan hệ giữa cỡ hạt pha tĩnh ( dp) và chiều dài cột tách L (mm) phải đạt đ−ợc tối thiểu nh− trong bảng 5.1 sau đây cho các loại hỗn hợp mẫu khác nhau.
Bảng 5.1. Yêu cầu của tỷ số L/dp trong HPLC Loại chất Tỷ số (L/dp) phải:
Các chất khó tách => 30.000
Trung bình =>20.000
Dễ tách =>10.000
Nh− vậy nếu cỡ hạt pha tĩnh là 10, 5, 3, 1,7 àm thì phải có chiều dài cột tách nh− trong bảng 5.2 sau đây, để vẫn có đ−ợc hiệu quả tách tốt một hỗn hợp chất khó tách.
Bảng 5.2. Mối quan hệ chiều dài cột và cỡ hạt pha tĩnh (L/dp) Tỷ lệ (L/dp) có Năm sản xuất TRi (phút)
300/10 30.000 1980 25-30 150/5 30.000 1995 10-15 100/3 33.000 2000 5-10 50/1,7 30.000 2004 1-3 Muốn có đ−ợc sự tách tốt, tức là phải có số đĩa N của cột tách HPLC lớn, điều đó nghĩa là phải có các pha tĩnh ( chất nhồi cột ) có kích th−ớc hạt rất nhỏ ( phải d−ới 2 micromets ), lại phải đồng đều và chịu đ−ợc áp suất rất cao hơn các pha tĩnh đã có của HPLC. Vì khi các hạt pha tĩnh càng nhỏ, thì áp suất bơm pha động qua cột tách càng phải càng cao, phải trên 1000 bar.
Ví dụ với pha tĩnh cỡ hạt 5 àm, cột dài L=150 mm, đ−ờng kính cột 4,6 mm, muốn có tốc độ pha động 1 mL, chúng ta đã phải bơm pha động với áp suất là 180-200 bar. Còn nếu pha tĩnh 1,8 àm, cột chỉ dài L=50 mm, đ−ờng kính 4,6 mm, để có cùng độ phân giải nh− cột cỡ hạt 5 àm, thì muốn đ−ợc tốc độ pha động cũng 1 mL, chúng ta phải bơm pha động với áp suất gấp 3,5 lần lớn hơn ( gần 800 bar ).
Theo lý thuyết, cứ muốn tăng đ−ợc 20% hiệu lực cột tách ( số N ) thì phải tăng đến 80% áp suất bơm pha động vào cột tách. Nh− thế nếu muốn có đ−ợc sự tăng 70% hiệu lực cột ( số N ), thì phải tăng đến 780% áp suất bơm pha động. Biểu đồ trong hình 5.1. sau đây cho chúng ta biết mối quan hệ giữa cỡ hạt pha tĩnh (dp) và áp suất (P) phải bơm pha động qua cột tách.
Do đó xuất hiện khái niệm Sắc ký lỏng mới : Ultra Performance Liquid Chromatography ( UPLC ). Song vì phải thực hiện tách d−ới áp suất rất cao ( 800- 1500 bar ), nên còn đ−ợc gọi là Sắc ký lỏng Siêu áp : Ultra Pressure
Liquid Chromatography ( viết tắt: UPLC ).
Với các điều kiện công nghệ hoá học hiện nay ( sau nh−ng năm 1996 ), vấn đề công nghệ của việc tổng hợp các pha tĩnh trên nền Silica có cỡ hạt từ 1-2 àm đều có thể thực hiện đ−ợc. Các công ty sản xuất máy HPLC lớn của thế giới nh− Waters, Agilent, Perkin Elmer, .. đều đã có cung cấp các pha tĩnh cho UPLC có cỡ hạt từ 1,4 – 2,0 àm, với cột tách chiều dài chỉ 5-6 cm, mà vẫn đảm bảo đ−ợc số đĩa N rất cao ( trên 220.000 đĩa/1m ) và tỷ số L/dp >30.000. Điều này có thể thấy trong ví dụ hình 5.1 và 5.2 trong quá trình tách hỗn hợp 9 chất với hai hệ HPLC và UPLC.
♦ Với hệ HPLC: L=100x2,1 mm, pha tĩnh 4,8 àm, F=1 mL, phải mất 10 phút các chất mới ra hết và mất đến 10 mL pha động.
♦ Với hệ UPLC: L = 30x2,1 mm, pha tĩnh 1,7 àm, F=1,5mL, chỉ mất 1,6 phút các chất đã ra hết và ta chỉ mất có 2,5 mL pha động.
Nef(N/m)
áp suất ặ bar
So sánh hai kết quả tách này chúng ta thấy: + Tốc độ tách tăng trên 5 lần.
+ Thời gian tách giảm đ−ợc trên 4 lần.
+ Dung môi ( pha động ) cho hệ UPLC chỉ tốn 1/4 so với HPLC.
+ Về áp suất bơm MP: Hệ HPLC: 200-210 bar. Còn hệ UPLC: 870-900 bar.
2.2. Trang thiết bị UPLC
Về trang thiết bị ( phần cứng ), đã đ−ợc phát triển và hoàn thiện khá tốt. Nhiều hệ thống máy UPLC ra đời đã đáp ứng đ−ợc các yêu cầu cần thiết của kỹ thuật phân tích UPLC. Đó là bốn vấn đề công nghệ sau đây.
2.2.1. Bơm cao áp cho UPLC
Các hệ bơm cao áp của kỹ thuật UPLC không những phải bơm đ−ợc pha động với áp suất rất cao qua cột tách sắc ký, để có đ−ợc tốc độ pha động mong muốn, mà còn phải bền và ổn định ( lặp lại tốt ), sự điều chỉnh tốc độ bơm mong muốn phải dễ dàng. Việc thực hiện gradient pha động ở áp suất cao. Các hệ thống máy bơm cao áp của Waters, Agilent, Perkin Elmer,.. đều đáp ứng đ−ợc áp suất cao từ 700- 1500 bar, với tốc độ từ 0,1 – 10 mL/phút. Ví dụ Model Sery Acquity Pump của Waters cung cấp 2004. Hình 5.2 là ví dụ so sánh hai hệ bơm của Waters trong HPLC và UPLC.
2.2.2. Van bơm mẫu
Khi cỡ hạt pha tĩnh nhỏ, cột sắc ký nhỏ và ngắn 9 L=50-60 mm), thì thể tích cột tách cũng khá nhỏ, nên thể tích của mỗi lớp chất ( đĩa ) tất nhiên sẽ nhỏ theo, Vì thế l−ợng mẫu bơm vào cột tách cũng phải nhỏ. Theo lý thuyết nó chỉ đ−ợc phép là 5 àL hay nhỏ hơn, để đảm bảo không bão hoà cột. Do đó các van bơm mẫu cũng phải cái tiến, để bơm đ−ợc l−ợng mẫu nhỏ, áp suất cao, có độ lặp lại tốt và chính xác.
Van bơm mẫu cho UPLC của các hãng hiện nay đều có cung cấp vòng mẫu hay ch−ơng trình nạp mẫu với thể tích cố định ( 5 hay 3 àL) hay biến thiên theo ch−ơng trình tự động. Các kỹ thuật và trang thiết bị nạp mẫu vào cột tách sắc ký hiện nay cho UPLC hay HPCEC, đều có thể nạp đ−ợc l−ợng mẫu từ 5 nL ( nanôlit ) trở lên rất chính xác và lặp lại tốt.
2.2.3. Detector phát hiện chất phân tích
Cùng với van bơm mẫu, các loại detector cũng phaỉ cải tiến. Vấn đề ở đây là: Bộ phân FlowCel, bộ nhận tín hiệu ( Các Censor ), và hệ điện tử. Khi cỡ hạt pha tĩnh nhỏ, cột sắc ký nhỏ và ngắn, thể tích cột nhỏ, thì thể tích của mỗi lớp chất ( đĩa ) tất nhiên sẽ nhỏ theo, Vì thế FlowCel ( buồng đo ) của detector cũng phải nhỏ.
Theo lý thuyết nó chỉ đ−ợc phép là 2 àL hay nhỏ hơn, để có thể lấy đ−ợc thể tích của từng phân đoạn ( đĩa, hay lớp của 1 chất ) vào buồng đo để phát hiện. Hiện nay FlowCel của detector UV/VIS và huỳnh quang th−ờng là 0,5- 2,0 àL, hoàn toàn đáp ứng đ−ợc kích th−ớc cột tách của UPLC.
Tiếp đó là các nhân quang ( Sensor ), hệ điện tử của các loại detector, các trang thiết bị ghi đo tín hiệu sắc ký cũng đ−ợc phát triển và hoàn thiện cho phép phát hiện l−ợng chất rất nhỏ, cở ppb đến ppt.
2.3. Phần mềm ( ch−ơng trình ) điều khiển
Khi cột tách nhỏ, l−ợng chất nhỏ ( nồng độ nhỏ ), thể tích mẫu nạp vào cột tách nhỏ, thời gian tách rất ngắn,.. nên cũng phải có các ch−ơng trình điều khiển toàn bộ hệ thống hoạt động đồng bộ là điều không thể thiếu. Vì nếu vận hành bằng tay sẽ là rất chậm, ví dụ việc bơm l−ợng mẫu nhỏ vào cột tách, việc ghi nhận tín hiệu trong FlowCell, việc ghi nhận số đo,.. cũng phải xẩy ra trong thời gian rất ngắn, th−ờng là cỡ d−ới 0,1 giây. Vì quá trình tách và thời gian pic chỉ xẩy ra trong khoảng 1-10 giây là xong và cho sắc độ tách một hỗn hợp mẫu có hàng chục chất chỉ trong vài phút ( 2-6 phút ).
Theo các yêu cầu đó, hiện nay các hệ máy UPLC đều hoạt động tự động theo ch−ơng trình từ lúc nạp mẫu cho đến khi quá trình tách kết thúc và cho ra kết quả ( ghi vào đĩa hay in ra giấy ).