Trong quá trình sắc ký, các quá trình hoá học, hoá lý xẩy ra trong cột tách là những quá trình, những cân bằng động giữa chất tan với pha động và pha tĩnh. Đó là những quá trình phức tạp, xẩy ra đồng thời với nhau và luôn luôn có những ảnh h−ởng t−ơng hỗ đến nhau kể từ lúc chất mẫu đ−ợc nạp vào cột tách cho đến lúc chúng đ−ợc rửa giải ra khỏi cột tách. Khi mẫu đã đ−ợc nạp
vào cột tách và trong quá trình sắc ký, một phần tử ( ion hay phân tử ) của chất tan luôn luôn nhẩy từ pha tĩnh vào pha động và ng−ợc lại, kể từ đầu cột đến cuối cột tách. Nh− thế suốt trong thời gian l−u tRi của nó ở trong cột tách, phân tử chất tan đã có hàng ngàn lần nó bị pha tĩnh hấp thụ, rồi lại bị rửa vào pha động cùng với sự chuyển dịch của pha động từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Trong quá trình đó, có lúc chất tan bị pha tĩnh giữ, tức là lúc nó bị pha tĩnh hấp thụ, nh−ng có lúc chất tan nằm trong pha động, lúc này chúng chuyển động theo pha động và không bị l−u giữ. Nh− thế, thời gian chất tan bị l−u giữ thực trong pha tĩnh, tức là ở trong cột sắc ký sẽ là:
t’Ri = ( tRi - to ) (2.51)
ở đây to đ−ợc gọi là thời gian không l−u giữ của chất tan.
Nh− vậy trong mỗi hệ pha, thời gian không l−u giữ của chất tan là khác nhau. Với một pha tĩnh nhất định, t0 chỉ phụ thuộc vào thành phần và tốc độ của pha động. Từ những nghiên cứu thực nghiệm, ng−ời ta thấy rằng, trong các hệ pha có thời gian l−u của chất tan không lớn lắm ( nhỏ hơn 5 phút ), thì giá trị của t0 là rất nhỏ, có thể gần bằng 0. Với một hệ pha đã chọn, và trong các điều kiện nhất định, giá trị của t0 là nh− nhau cho tất cả các chất tan trong hỗn hợp mẫu đó. Giá trị này là đặc tr−ng cho một điều kiện sắc ký nhất định và nó chỉ thay đổi khi thành phần và tốc độ pha động thay đổi.
Việc xác định giá trị không l−u giữ to là một việc hết sức phức tạp và khó khăn. Nó đòi hỏi phải có các trang bị đặc biệt. Đến nay có nhiều ph−ơng pháp khác nhau để xác định giá trị thời gian không l−u giữ to; Nh−ng ch−a có một ph−ơng pháp nào phù hợp nhất và cho kết quả chính xác cho tất cả các hệ pha. Song, tất cả chỉ là xác định gần đúng.
Hơn nữa trong thực tế của sự tách sắc ký, thời gian không l−u giữ này cũng không ảnh h−ởng đến kết quả tách sắc ký một hỗn hợp mẫu. Vì thế chỉ trong trừờng hợp cần thiết ng−ời ta th−ờng xác định giá trị t0 này bằng thực nghiệm, nhờ một chất tan không bị l−u giữ trong hệ pha đó. Ví dụ trong các sắc ký hệ pha ng−ợc của chất nhồi loại C8 và C18, và pha động là (MeOH+H2O) hay (CH3OCN + H2O) thì ng−ời ta th−ờng chọn Urasil. Vì trong các hệ pha này chất Urasil không bị pha tĩnh hấp phụ, nó chảy ra khỏi cột tách cùng với pha động. Vì thế thời gian l−u của nó chính là giá trị to của hệ sắc ký đó và cũng là giá trị tM của pha động.
Trong nghiên cứu khoa học, ý nghĩa của việc xác định giá trị thời gian không l−u giữ t0 là để giúp ta xem xét chuẩn đoán tính chất l−u giữ của các chất trong các hệ pha khác nhau, trong các điều kiện sắc ký khác nhau của nghiên cứu các vấn đề lý thuyết sắc kí.
Bảng tóm tắt các thông số đặc tr−ng trong HPLC No Đại l−ợng Công thức 1 Thời gian l−u thực, tR’ Hay là: tR’ = ( tR – t0 ) tR’=[16.(R)2.H]/u[α(α-1)]2.[(1+ki’)/(ki’)]2 2 Tốc độ MP (mL/Ph) VM = F.tM 3 Tốcđộtuyến tính,u(mm/ph) u = L/tM = F.[ (1)/(r2.εr.π)] 4 Hệ số dung tích, ki’ ki’ = (tRi-t0)/t0 5 Hệ số phân bố, Ki Ki = ki’(VMP/VSP) 6 Hệ số chọn lọc, α α = [(tR)B-t0]/ [(tR)A-t0] 7 Độ phân giải, R R = 2.[(tR)B-(tR)A]/(WB-WA) 8 Số đĩa lý thuyết, N N = 16.(tR)2/(W)2 9 Số đĩa hiệu dụng, Nef Nef =N.[(ki’)2/(1+ki’)2]
10 Chiều cao đĩa lý thuyết,H H = L/N
11 Chiêùcao đĩa hiệudụng, Hef Hef = L/Nef
12 Nồng độ chật ở đỉnh pic Ci(Max) = (Co/VMax). (N/2π)0,5
13 Hệ số thấm MP Ф = [tM.(dp)2.UP]/[(L)2.η]
14 Độ cân đối pic, Asys Asys = b/a
15 Tỷ số pha, q q = VSP/VMP 16 Quqn hệ: Ki,ki’,q ki’ = q.Ki 17 Hệ số ki’ ki’ = m(SP)/m(MP) 18 Thể tích SP trong cột, VSP VSP = ( V0 – F.tRi) 19 Thể tích MP trong cột, VMP VMP = (F.tRi) 20 Thể tích cột tách, V0 V0 = ( VSP + VMP)
21 Hệ số phân bố, Ki Ki = Ci(SP) / Ci(MP)