I. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc c a phương pháp biuret, quá trình phản ứng bao gồm 2 giai đoan. Trong giai đoạn 1 protein tạo phức với đồng 2 ở mơi trường kiềm sau đĩ phức protein tiếp tục phản ứng với acidic molybdenum and tungsten ion cĩ trong thuốc thử folin). Sản ph m c a phản ứng trên là phức heteropolymolybdenum cĩ màu xanh và hấp phụ cực đại ở bước sĩng 750nm.
- Độ nhạy cao hơn phương pháp biuret cĩ thể xác định được m u vật cĩ hàm lượng protein rất thấp)
- Độ hấp phụ ch tuyến tính với hàm lượng protein khi hàm lượng protein thấp.
- Phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng các loại acid amin try, trp và các acid amin cĩ tính phân cực ở mạch bên)
- Nhạy với các chất oxy hĩa và độ chính xác phụ thuộc lớn vào kỹ thuât thao tác
II. Dụng cụ, hĩa chất
1. Dụng cụ, thiết bị
- Máy so màu
- Dụng cụ th y tinh ống nghiệm, cốc th y tinh, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipette). - Micropipette (50 – 100 µl, 100 – 1000 µl). 2. Hĩa chất - BSA. - NaOH. - Na2CO3. - CuSO4.5H2O. - Folin-Ciocalteau. - C4H4KNaO6.4H2O. III. Tiến hành 1. Pha thuốc thử
1. Thuốc thử A (Reagent A): 2 g C4H4KNaO6.4H2O + 100 g Na2CO3 + 500 ml NaOH 1N, tất cả được hịa tan và làm đầy đến 1000 ml b ng nước cất dung dịch giữ được 3 tháng).
2. Thuốc thử B (Reagent B): 2 g C4H4KNaO6.4H2O + 1 g CuSO4.5H2O + 10 ml 1N NaOH. Sau khi hịa tan, dung dịch trên được làm đầy đến 100 ml b ng nước cất dung dịch giữ được từ 2 – 3 tháng)
3. Thuốc thử C (Reagent C): 1 thể tích thuốc thử Folin-Ciocalteau + 15 thể tích 2O.
2. Pha dung dịch BSA chuẩn
Hịa tan 0.01 g BSA trong 1000 ml H2O àm lượng 0.01 mg/ml = 10 µg/ml).
3. Xây dựng đường chuẩn
- Cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch BSA chu n và các loại thuốc thử với thứ tự và thể tích như sau bảng 1).
Bảng 1. Thể tích các loại thuốc thử cho vào ống nghiệm
STEP REAGENT TUBES
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 BSA solution (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2 Distilled water (ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 3 Reagent A (ml) 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 4 Incubate the tubes 10 min in a 50 degrees C bath, then cool to room
temperature.
5 Reagent B (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 6 Incubate 10 min at room temperature
7 Reagent C (ml) 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 8 Incubate the tubes 10 min in a 50 degrees C bath, then cool to room
temperature.
9 Measure absorbance at 750 nm in 1 cm cuvettes
Final assay volume (ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Concentrations BSA
(µg/ml) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
4. Kết quả đường chuẩn
Kết quả đo mật độ quang học được thể hiện qua bảng 2.
Bảng 2. Mật độ quang học của các mẫu đường chuẩn
Tubes 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 Concentratio n BSA (µg/ml) 02 04 06 08 10 12 14 16 18 20 OD750
Từ kết quả đo ở trên, ta xây dựng được phương trình đường chu n: Y = A*X + B, R2 =…. 1)
Trong đĩ: Y: là OD750
X: àm lượng protein (µg/ml) R2: ệ số tương quan
Tiến hành thí nghiệm như trên nhưng thay BSA solution b ng dung dịch m u cần đo. Gọi độ hấp phụ c a m u ở bước sĩng 750 là ODm
Thay giá trị Odm c a m u vào phương trình 1) ta tính được hàm lượng protein c a m u.
5. Ưu và nhược điểm của phương pháp Lowry
Ưu điểm
- Độ nhạy cao gấp 50-100 lần phương pháp Biure) - Tương đối đơn giản khoảng 1-1,5 giờ)
Nhược điểm
Bài 13 : Kiểm nghiệm Surimi, kiểm nghiệm rong biển 13.1. Kiểm nghiệm Surimi ( theo TCN119-1998)
13.1.1. Kiểm nghiệm cảm quan
Ch tiêu cảm quan và hĩa lý c a Surimi phải theo đúng mức và yêu cầu qui định trong bảng sau :
Bảng : Ch tiêu cảm quan và hĩa l của Surimi
Ch tiêu Mức và yêu cầu
ạng đặc biệt ạng 1 ạng 2
1. Màu sắc Trắng đến trắng ngà
2. Mùi Mùi đặc trưng c a sản ph m surimi cá biển, khơng cĩ mùi lạ
3. Ðộ p 6,5 - 7,2
4. àm lượng nước, tính b ng tỷ lệ
%khối lượng, khơng lớn hơn
76,0 78,0 80,0
5. Lượng tạp chất, tính theo thang điểm 10 bậc, trong khoảng
10 - 9 8 - 7 6 - 5
6. Ðộ dẻo xếp theo loại A, B, C,D), khơng nhỏ hơn AA A B 7. Ðộ đơng kết tính trên đồ thị, theo g.cm, khơng nhỏ hơn 350 330 300 8. Ðộ trắng, tính b ng tỷ lệ %, khơng nhỏ hơn 50 45 40 13.1.2. Xác định độ pH a) Chu n bị m u thử
Trộn đều m u thử, sau đĩ cho vào 3 cốc thuỷ tinh dung tích 250 ml) mỗi cốc 5 g m u rồi trộn đều với 45 ml nước cất.
b) Tiến hành thử
Dùng máy pH meter (Beckman Model 3560 digital p meter) để đo p c a dung dịch trong mỗi cốc. Lấy kết quả là trung bình cộng c a 3 lần đo trong cùng 1 m u thử.
13.1.3. Xác định tạp chất
a) Lấy m u : Theo TCVN 5276 - 90
b) Chu n bị m u thử
Dàn 10 g m u thử đã tan băng mỏng tới 1 mm trên mặt phẳng nền trắng. c) Tiến hành thử
- Dùng mắt thường để quan sát và dùng panh đếm số m u cĩ tạp chất gồm : xương, da, vây, vảy và những vật lạ khác ) cĩ trong m u thử.
- Tạp chất cĩ kích thước lớn hơn 2 mm, tính 1 đơn vị. Tạp chất cĩ kích thước nhỏ hơn 2 mm, tính 1/2 đơn vị.
- Số tạp chất cĩ trong m u thử, được đánh giá theo thang điểm 10 bậc quy định trong bảng sau :
Bảng : Thang điểm đánh giá tạp chất trong Surimi
Ðiểm Số tạp chất đếm được 10 0 9 1 - 2 8 3 - 4 7 5 - 7 6 8 - 11 5 12 - 15 4 16 - 19 3 20 - 25 2 26 - 30 1 khơng nhỏ hơn 31 13.1.4. Xác định độ đơng kết
Ðộ đơng kết là mức độ tạo keo dính c a sản ph m, cĩ khả năng chịu được tác động c a lực nén
a) Chu n bị m u thử :
Cho khoảng 120 - 150 g Surimi đơng lạnh vào máy đảo trộn Ser N0 92 AP 40 AW. 70 Bibun Corp. Fukuyama Japan) cùng với 2,5% muối, 30% nước đá rồi làm nhuyễn trong 30 phút.
Chuyển m u vào túi poliviniliden clorit, hoặc túi polietilen cĩ đường kính 48 - 50 mm, dài 25 - 30 cm. Buộc 2 đầu túi lại, nhúng m u vào nước ấm nhiệt độ 400C trong 20 phút. Sau đĩ, nhúng m u vào nước nĩng nhiệt độ 90 oC trong 20 phút.
Lấy m u ra và ngâm vào chậu nước cĩ nhiệt độ 20 – 300C để làm nguội. Giữ m u thử ở nhiệt độ trong phịng.
b) Tiến hành thử
- Xác định độ đơng kết c a Surimi trên máy đo Fudoh Rheometer, Model KRM 2002 J. Fudoh Kogyo Co.Ltd. Japan), cĩ đường kính trụ nén 5 mm, độ dài trụ 10 cm. Ch tiến hành thử m u ở nhiệt độ 20 - 30 oC tốt nhất ở 25 oC ).
- Cắt m u thử thành từng khoanh, dày 25 mm và bĩc bỏ màng bọc ngồi.
- Ðặt trụ nén thẳng gĩc với mặt cắt c a m u thử, tăng dần trọng lượng trên bề mặt trụ nén cho tới khi bề mặt m u bị th ng.
- Căn cứ vào đồ thị được vẽ trên máy trong quá trình xác định để tính độ đơng kết c a m u thử. Ðộ đơng kết GS) được tính theo cơng thức :
GS = L.h (g-cm)
Trong đĩ : L : Trọng lượng cần thiết để làm th ng bề mặt m u thử, tính b ng g. h : Ðộ cao khi nén xuống c a mỗi đơn vị đo, tính b ng cm.
13.1.5. Xác định độ dẻo
Ðộ dẻo là mức độ dai và đàn hồi c a sản ph m, cĩ khả năng chịu được tác động c a lực uốn hoặc lực kéo.
Cắt m u thử thành từng lát mỏng 3 mm. Dùng ngĩn tay uốn gập những lát mỏng để xác định độ dẻo.
Mức độ dẻo c a m u thử được đánh giá theo thang điểm 5 bậc quy định trong Bảng.
Bảng : Thang điểm đánh giá độ dẻo của Surimi
Ðiểm Trạng thái mẫu Xếp loại
5 Khơng bị gãy khi gập 2 lần gập đơi rồi lại gập tư )
AA
4 Khơng bị gãy khi gập 1 lần A
3 Xuất hiện sự rạn nứt khi gập 1 lần và để lâu B 2 Xuất hiện sự rạn nứt ngay sau khi gập 1 lần C
1 Bị nứt ngay khi vừa uốn cong D
13.2. Kiểm nghiệm rong biển (TCVN 3590:1988)
13.2.1. Kiểm nghiệm cảm quan
- Màu sắc - Mùi - Vị
- Trạng thái, cấu trúc
13.2.2. Xác định hàm lượng agar – agar
Bước 1: Xử lý rong: Cân 10g rong câu cho vào cốc th y tinh 500ml, đong 250ml nước cất + 6g NaO tinh thể, đảo trộn đều, đặt cốc lên bếp điện, đun 50 phút. Khi đun nhớ nhấn chìm rong cho ngập trong dung dịch kiềm.
Tiếp đĩ gạn dung dịch qua 2 lớp vải màn, dùng nước rửa nhiều lần rửa dưới vịi nước chảy, để yên 5 – 10 phút) rửa cho đến khi p = 7 là được. M u sau khi rửa xong ngâm trong dung dịch axit xitric 0,2% với thể tích 150ml, để ở nhiệt độ phịng, thời gian ngâm là 30 phút. Chú ý nhấn chìm rong ngập trong dung dịch) rồi rửa đến khi p = 7 động tác rửa giống như trên)
Bước 2: Nấu chiết
+ Nấu chiết lần 1: đun sơi 200ml nước cất trong cốc th y tinh 500ml, cho rong đã xử lý vào tiếp tục đun, khi bắt đầu sơi cho vào 1 – 2ml dung dịch C 3COO 10%, đảo đều, tiếp tục đun sơi 20 phút, cho vào 5ml Na2B4O7 4%, lắc đều, đun sơi 15 phút, rồi tiến hành lọc qua 10 lớp vải màn đặt trên phễu. Dung dịch được lọc chứa vào 1 khay men nhỏ, để nguội. Phần bã tiếp tục được nấu chiết lần 2. Dùng nước cất đun sơi tráng vải lọc vài lần, nước tráng cũng được dùng nấu chiết lần 2
+ Nấu chiết lần 2: Bã cịn lại được nấu chiết lần 2 với nước tráng ở trên, thời gian sơi 30 phút. Khi kết thúc đem lọc để thu dịch lọc giống như trên, dịch lọc 2 để riêng vào 1 khay nhỏ để nguội.
Bước 3: Để lạnh đơng
Dung dịch agar sau khi đơng với lần chiết thứ nhất. Thạch đơng được cắt thành sợi, với lần chiết thứ hai khơng cần cắt sợi, sau đĩ để trong t lạnh t0 = -5 ÷ -100C cho đến khi đĩng băng hồn tồn.
Bước 4: Tan băng tách nước
Thạch đĩng băng được làm tan băng b ng nước sạch, tan băng nhanh, nước được gạn bỏ qua lớp vải màn, sợi agar để cho ráo nước.
Bước 5: Sấy khơ
Agar được sấy trong t sấy t0
= 50 – 600C agar được lĩt trên vải màn) sau đĩ tiếp tục sấy ở t0
= 1050C trong 2 giờ. Sấy đến khối lượng khơng đổi, để nguội trong bình hút m và cân. Tính kết quả: X = .!00 ). 100 ( 100 . P W A (%)
A: khối lượng c a agar khơ sau khi sấy g) W: độ m c a rong câu đem xác định %) P: khối lượng c a rong câu đem xác định g)
- Khi nấu chiết yêu cầu sợi rong phải được phá h y hồn tồn phải tan hết), nếu sợi rong cịn nguyên hoặc ch bị phá h y 1 phần, m u phải được xác định lại b ng cách tăng nồng độ axit xitric. Khi được xử lý tùy theo mức độ tăng từ: 0,25; 0,3…khơng được vượt quá 0,4%, các điều kiện khác v n giữ nguyên.
- Khi tiến hành lọc b ng vải màn 10 lớp, cho chảy tự do đến khi dung dịch khơng tự chảy nữa, vắt nhẹ đến khi dung dịch tách hết khỏi bã.
- Yêu cầu dung dịch lọc phải thật trong.
13.2.3. Xác định sức đơng (TCVN 3591:1988)
Sức đơng c a agar – agar là một trong những ch tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng c a agar và rong câu.
Tiến hành:
a.Điều chế thạch cĩ nồng độ 1% agar:
Cân 2g agar – agar cho vào bình cầu chịu nhiệt 500ml, căn cứ vào độ m c a agar đã được xác định, tính lượng nước cho vào sao cho agar khi hịa tan cĩ nồng độ 1% theo cơng thức:
N = A x ( 99 – W) (ml) A: khối lượng m u agar đem đi thí nghiệm W: độ m c a agar %)
N: lượng nước cần thiết phải cho vào ml)
Sau khi cho nước vào, lắp ống sinh hàn hồi lưu, lắc đều để yên 30 phút sau đĩ đặt lên bếp điện, đun sơi. Trong quá trình đun sơi m u để hịa tan cần phải điều ch nh nhiệt vừa phải tránh sơi nhỏ tạo màng trên bề mặt, tránh sơi mạnh gây trào, bốc hơi nước qua ống sinh hàn ra ngồi.
Đun sơi cho đến khi agar tan hồn tồn, tháo ống sinh hàn, đổ dung dịch vào ống khuơn, để yên 30 phút cho đơng lại. Tiếp tục cho ống khuơn vào nước cĩ nhiệt độ 200C khoảng 2 – 4 giờ
b.Đo sức đơng:
Lấy m u agar ra khỏi ống khuơn, dùng dao cắt m u, cắt khoanh với độ dày 15 mm, 2 bề mặt khoanh thạch phải b ng phẳng và song song với nhau. Đưa khoanh thạch vào máy đo sức đơng sao cho tâm c a khoanh thạch trùng với tâm c a con dấu máy đo sức đơng. Đặt nhẹ con dấu lên trên bề mặt thạch. Đặt nhẹ cốc hứng lên trên đĩa gắn cùng với trục con dấu, mở khĩa cho nước chảy từ từ với lưu lượng 1 – 2 ml/phút cho đến khi thạch bị vỡ và đem cân tồn bộ khối lượng tổng cộng nén trên bề mặt thạch tính b ng gam. Với mỗi m u agar tiến hành đo 3 lần, sai số giữa 3 lần đo liên tiếp khơng sai khác quá 1 gam.
Sức đơng c a agar được tính b ng cơng thức: D = 3 3 3 3 2 1 A A A (g/cm2)
A1, A2, A3: là giá trị được đo ở 3 lần xác định Ghi chú: Nếu m u chưa kịp đo phải giữ ở nhiệt độ 200C cho đến khi cắt khoanh. Khi cắt khoanh yêu cầu phải đo ngay.
13.2.4. Xác định hàm lượng tạp chất a. Dụng cụ a. Dụng cụ - Giấy trắng khổ 500 x 500mm - Kẹp gắp - Cân phân tích b. Tiến hành
Từ m u trung bình, cân khoảng 10-15g agar làm m u phân tích chính xác đến 0,001g. Đỗ dần m u phân tích ra m u giấy trắng, dùng kẹp gắp dàn mỏng và nhặt tất cả mảnh tạp chất cĩ trong m u vào chén cân đã sấy khơ và biết khối lượng.
Cân chén chứa tạp chất chính xác đến 0,001g c. Kết quả
àm lượng tạp chất Tc)tính b ng % khối lượng theo cơng thức: 100 ) ( x a c b TC
Bài 14 : Kiểm nghiệm chè, café
14.1. Kiểm nghiệm chè
14.1.1. Kiểm nghiệm cảm quan
- Màu sắc - Mùi - Vị
- Trạng thái
14.1.2. Xác định hàm lượng chất tan (theo TCVN 5610-1991) a. Nguyên lý: a. Nguyên lý:
Chiết chè b ng nước nĩng sau đĩ đem sấy chất chiết đã thu được.
b. Dụng cụ, hĩa chất:
- Bình cầu đáy b ng dung tích 500ml cĩ lắp ống sinh hàn hồi lưu - Nồi cách th y
- Bình định mức 500ml
- Cân phân tích sai số khơng quá ± 0,001g - Phễu lọc, bình hút m
- T sấy điều ch nh được nhiệt độ 103 ± 2)oC
c. Tiến hành:
- Xác định độ m c a chè b ng phương pháp sấy
- Cân 50g chè với độ chính xác đến 0,001g cho vào bình cầu dung tích 500ml, lắp vào ống sinh hàn hồi lưu, đặt bình cầu trên nồi cách th y 60 phút, khuấy đều chè trong bình để chè khơng dính vào thành bình.
- Dịch chiết được chuyển vào định lượng vào bình định mức 500ml, thêm nước cất cho đ 500ml, khuấy c n thận và lọc trên giấy lọc khơ.
- Lấy 50 ml dung dịch vào cốc sứ khơ đã cân, làm bay hơi hết nước trên nồi cách th y, sau đĩ đặt cốc sấy cĩ phần cặn, đem vào t sấy ở nhiệt độ 103 ± 2)o