Đạm focmon bao gồm đạm c a axit amin, đạm c a amoniac, và đạm c a amin bậc 1 nhưng trên thực tế đạm amin bậc 1 rất ít nên đạm focmon bao gồm đạm N 3 và đạm axit amin.
a. Nguyên lý:
Các axit amin trong dung dịch nước thì trung tính khơng phải vì cĩ 2 nhĩm chức axit (– COOH) và amin (–NH2) trung hồ l n nhau mà do cả 2 nhĩm chức này đều yếu, điện ly kém.
Khi gặp focmon, nhĩm –NH2 kết hợp với focmon tạo thành nhĩm metylenic –N=CH2) mất tính chất kiềm. Do đĩ, tính chất axit c a nhĩm –COO ) nổi bật lên. Cĩ thể định lượng được b ng chất kiềm với ch thị phenolphtalein.
R CH COOH + HCHO R CH COOH + H2O
Nếu trong m u thử cĩ mặt các muối amoni. Vd: N 4Cl khi gặp formol cũng làm cho dung dịch trở thành axit :
4NH4Cl + 6HCHO (CH2)6N4 + 6H2O + 4HCl
b.Tiến hành:
Bước 1: Chu n bị dung dịch focmon trung tính: 50ml focmon + phenolphtalein 1% + NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch cĩ màu hồng nhạt.
Bước 2: Chu n bị cốc màu cĩ p = 9,2 (dung dịch Na2B4O7 0,03N ) + dung dịch đệm p = 9,2 : 20 ml
+ dung dịch ch thị : 1 ml + dung dịch focmon trung tính : 10 ml
Bước 3: Loại bỏ muối kết t a: Lấy 50ml m u đã chu n bị ở trên cho vào bình định mức 250ml, thêm vào vài giọt phenolphtalein 1% và 2g BaCl2, cho từ từ Ba O )2 bão hồ vào cho đến khi dung dịch cĩ màu đỏ giống như màu c a cốc màu m u cĩ p = 9,2. Thêm nước cất cho đ vạch, lắc đều rồi để lắng 15phút nếu cĩ kết t a thì lọc loại bỏ kết t a).
Bước 4: Phản ứng formol: Dùng pipet lấy chính xác 20ml dịch lọc cho vào cốc thuỷ tinh 250ml sạch, rồi đem trung hồ b ng dung dịch Cl 0,1N cho đến khi dung dịch mất màu. Thêm khoảng 10ml focmon trung tính, rồi cho vào t lạnh 15 – 20 phút.
Bước 5: Chu n độ: Dùng dung dịch NaO 0,1N để chu n độ cho đến khi dung dịch trong cốc cĩ màu đỏ giống như màu c a cốc màu m u dung dịch cĩ p = 9,2). Xác định thể tích NaO 0,1N tiêu tốn. c.Tính kết quả: ) / ( 1000 0014 , 0 l gN V F A NF Trong đĩ:
0,0014: số gam nitơ tương đương với 1ml NaO 0,1N A: số ml NaO 0,1N tiêu tốn khi chu n độ
F: hệ số pha lỗng F = F1 x F2 = 25 x (250/50) = 125 V: số ml m u đem đi thí nghiệm
Đạm axit amin b ng đạm focmon trừ đi đạm N 3
Naa = NF – NNH3 (gN/lít) 12.8. Một số phương pháp định lượng protein
12.8.1. Định lượng protein theo phương pháp Biuret 1. Nguyên tắc 1. Nguyên tắc
Trong mơi trường kiềm, liên kết peptide c a phân tử protein phản ứng với thuốc thử biuret tạo ra phức chất màu tím xanh tím). Cường độ màu c a dung dịch phản ánh số lượng liên kết peptide, tại bước sĩng 570 nm. Thơng qua đường chu n protein ta cĩ thể xác định được hàm lượng protein ở trong m u.
2. Đối tượng
M u vật cĩ hàm lượng protein thấp Ví dụ: m u tơm đơng lạnh hoặc phế liệu tơm).
3. Dụng cụ, thiết bị
- Máy so màu.
- Bể ổn nhiệt.
- Dụng cụ th y tinh ống nghiệm, cốc th y tinh, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipette).
- Micropipette (50 – 100 µl, 100 – 1000 µl).
4. Hĩa chất, thuốc thử.
a. Dung dịch NaO 4% b. Dung dịch thuốc thử Biuret
Hịa tan 1,5g Đồng Sulfate (CuSO4) và 6,0 g Sodium potassium tartrate (KNaC4H4O6. 4H2O) trong 500 ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300 ml NaO 10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi định mức đến 1000 ml b ng nước cất.
c. Bovine serum albumin BSA) chu n
Pha dung dịch chu n BSA: Hịa tan 0,5g BSA vào trong 50 ml nước cất, khuấy dần dần đến khi BSA tan hết rồi định mức lên 100 ml b ng nước cất nồng độ BSA: 10 mg/ml).
5. Tiến hành
5.1. Phương pháp xử lý mẫu
Ngâm 3 – 5 g m u khơ hoặc 3 – 10 g m u ướt W g m u)) trong dung dịch NaO 4% với tỷ lệ 1: 10 w/v) hoặc 1:15 w/v)), sau đĩ ở 95oC trong 6 giờ.
Sau khi , phần bã và phần dịch lỏng được tách riêng b ng cách lọc chân khơng. Phần dịch lọc được định mức đến một thể tích xác định b ng nước cất Vl).
Chu n bị dung dịch protein chu n BSA) với hàm lượng 10 mg/ml và 6 ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm lần lượt 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 ml) dung dịch protein chu n trên, thêm nước cất vào lần lượt 6 ống trên với lượng như sau 1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0 ml). Tiếp tục thêm 4 ml thuốc thử Biuret, lắc đều rồi 30 phút ở nhiệt độ phịng.
Sau khi , dung dịch trên được xác định độ hấp thụ quang học ở bước sĩng 570 nm.
Dựa vào mối tương quan giữa hàm lượng protein và độ hấp thụ quang học để thiết lập phương trình đường chu n protein.
Phương trình đường chu n protein cĩ dạng: Y a*X b (1) Trong đĩ:
Y: Độ hấp thụ quang học tại bước sĩng 570 nm. X: àm lượng protein mg/ml).
a, b: ệ số.
5.3. Xác định hàm lượng protein trong mẫu
Lấy 10 ml dịch lọc m u đã chu n bị ở trên, tiến hành lọc lần 2 qua giấy lọc Whatman số 1.
Lấy 1 ml dịch sau khi lọc lần 2 bổ sung thêm 4 ml dung dịch thuốc thử biuret, 30 phút ở nhiệt độ phịng.
Sau khi , tiến hành đo độ hấp thụ quang học c a dung dịch ở bước sĩng 570 nm, ta xác định được giá trị Ym.
Thay giá trị Ym vừa xác định được vào phương trình 1) ta tính được giá trị Xm.
5.4. Tính kết quả.
àm lượng protein trong m u được xác định theo cơng thức sau:
%protein= Vl*Xm W*1000*100
Trong đĩ:
Vl: Thể tích dịch lọc ml)
Xm: àm lượng protein trong 1 ml dịch lọc mg/ml)
W: Khối lượng m u g).
1000: ệ số chuyển đổi giữa số g và mg.
12.8.2. Định lượng protein theo phương pháp Lowry I. Nguyên tắc I. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc c a phương pháp biuret, quá trình phản ứng bao gồm 2 giai đoan. Trong giai đoạn 1 protein tạo phức với đồng 2 ở mơi trường kiềm sau đĩ phức protein tiếp tục phản ứng với acidic molybdenum and tungsten ion cĩ trong thuốc thử folin). Sản ph m c a phản ứng trên là phức heteropolymolybdenum cĩ màu xanh và hấp phụ cực đại ở bước sĩng 750nm.
- Độ nhạy cao hơn phương pháp biuret cĩ thể xác định được m u vật cĩ hàm lượng protein rất thấp)
- Độ hấp phụ ch tuyến tính với hàm lượng protein khi hàm lượng protein thấp.
- Phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng các loại acid amin try, trp và các acid amin cĩ tính phân cực ở mạch bên)
- Nhạy với các chất oxy hĩa và độ chính xác phụ thuộc lớn vào kỹ thuât thao tác
II. Dụng cụ, hĩa chất
1. Dụng cụ, thiết bị
- Máy so màu
- Dụng cụ th y tinh ống nghiệm, cốc th y tinh, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipette). - Micropipette (50 – 100 µl, 100 – 1000 µl). 2. Hĩa chất - BSA. - NaOH. - Na2CO3. - CuSO4.5H2O. - Folin-Ciocalteau. - C4H4KNaO6.4H2O. III. Tiến hành 1. Pha thuốc thử
1. Thuốc thử A (Reagent A): 2 g C4H4KNaO6.4H2O + 100 g Na2CO3 + 500 ml NaOH 1N, tất cả được hịa tan và làm đầy đến 1000 ml b ng nước cất dung dịch giữ được 3 tháng).
2. Thuốc thử B (Reagent B): 2 g C4H4KNaO6.4H2O + 1 g CuSO4.5H2O + 10 ml 1N NaOH. Sau khi hịa tan, dung dịch trên được làm đầy đến 100 ml b ng nước cất dung dịch giữ được từ 2 – 3 tháng)
3. Thuốc thử C (Reagent C): 1 thể tích thuốc thử Folin-Ciocalteau + 15 thể tích 2O.
2. Pha dung dịch BSA chuẩn
Hịa tan 0.01 g BSA trong 1000 ml H2O àm lượng 0.01 mg/ml = 10 µg/ml).
3. Xây dựng đường chuẩn
- Cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch BSA chu n và các loại thuốc thử với thứ tự và thể tích như sau bảng 1).
Bảng 1. Thể tích các loại thuốc thử cho vào ống nghiệm
STEP REAGENT TUBES
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 BSA solution (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2 Distilled water (ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 3 Reagent A (ml) 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 4 Incubate the tubes 10 min in a 50 degrees C bath, then cool to room
temperature.
5 Reagent B (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 6 Incubate 10 min at room temperature
7 Reagent C (ml) 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 8 Incubate the tubes 10 min in a 50 degrees C bath, then cool to room
temperature.
9 Measure absorbance at 750 nm in 1 cm cuvettes
Final assay volume (ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Concentrations BSA
(µg/ml) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
4. Kết quả đường chuẩn
Kết quả đo mật độ quang học được thể hiện qua bảng 2.
Bảng 2. Mật độ quang học của các mẫu đường chuẩn
Tubes 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 Concentratio n BSA (µg/ml) 02 04 06 08 10 12 14 16 18 20 OD750
Từ kết quả đo ở trên, ta xây dựng được phương trình đường chu n: Y = A*X + B, R2 =…. 1)
Trong đĩ: Y: là OD750
X: àm lượng protein (µg/ml) R2: ệ số tương quan
Tiến hành thí nghiệm như trên nhưng thay BSA solution b ng dung dịch m u cần đo. Gọi độ hấp phụ c a m u ở bước sĩng 750 là ODm
Thay giá trị Odm c a m u vào phương trình 1) ta tính được hàm lượng protein c a m u.
5. Ưu và nhược điểm của phương pháp Lowry
Ưu điểm
- Độ nhạy cao gấp 50-100 lần phương pháp Biure) - Tương đối đơn giản khoảng 1-1,5 giờ)
Nhược điểm
Bài 13 : Kiểm nghiệm Surimi, kiểm nghiệm rong biển 13.1. Kiểm nghiệm Surimi ( theo TCN119-1998)
13.1.1. Kiểm nghiệm cảm quan
Ch tiêu cảm quan và hĩa lý c a Surimi phải theo đúng mức và yêu cầu qui định trong bảng sau :
Bảng : Ch tiêu cảm quan và hĩa l của Surimi
Ch tiêu Mức và yêu cầu
ạng đặc biệt ạng 1 ạng 2
1. Màu sắc Trắng đến trắng ngà
2. Mùi Mùi đặc trưng c a sản ph m surimi cá biển, khơng cĩ mùi lạ
3. Ðộ p 6,5 - 7,2
4. àm lượng nước, tính b ng tỷ lệ
%khối lượng, khơng lớn hơn
76,0 78,0 80,0
5. Lượng tạp chất, tính theo thang điểm 10 bậc, trong khoảng
10 - 9 8 - 7 6 - 5
6. Ðộ dẻo xếp theo loại A, B, C,D), khơng nhỏ hơn AA A B 7. Ðộ đơng kết tính trên đồ thị, theo g.cm, khơng nhỏ hơn 350 330 300 8. Ðộ trắng, tính b ng tỷ lệ %, khơng nhỏ hơn 50 45 40 13.1.2. Xác định độ pH a) Chu n bị m u thử
Trộn đều m u thử, sau đĩ cho vào 3 cốc thuỷ tinh dung tích 250 ml) mỗi cốc 5 g m u rồi trộn đều với 45 ml nước cất.
b) Tiến hành thử
Dùng máy pH meter (Beckman Model 3560 digital p meter) để đo p c a dung dịch trong mỗi cốc. Lấy kết quả là trung bình cộng c a 3 lần đo trong cùng 1 m u thử.
13.1.3. Xác định tạp chất
a) Lấy m u : Theo TCVN 5276 - 90
b) Chu n bị m u thử
Dàn 10 g m u thử đã tan băng mỏng tới 1 mm trên mặt phẳng nền trắng. c) Tiến hành thử
- Dùng mắt thường để quan sát và dùng panh đếm số m u cĩ tạp chất gồm : xương, da, vây, vảy và những vật lạ khác ) cĩ trong m u thử.
- Tạp chất cĩ kích thước lớn hơn 2 mm, tính 1 đơn vị. Tạp chất cĩ kích thước nhỏ hơn 2 mm, tính 1/2 đơn vị.
- Số tạp chất cĩ trong m u thử, được đánh giá theo thang điểm 10 bậc quy định trong bảng sau :
Bảng : Thang điểm đánh giá tạp chất trong Surimi
Ðiểm Số tạp chất đếm được 10 0 9 1 - 2 8 3 - 4 7 5 - 7 6 8 - 11 5 12 - 15 4 16 - 19 3 20 - 25 2 26 - 30 1 khơng nhỏ hơn 31 13.1.4. Xác định độ đơng kết
Ðộ đơng kết là mức độ tạo keo dính c a sản ph m, cĩ khả năng chịu được tác động c a lực nén
a) Chu n bị m u thử :
Cho khoảng 120 - 150 g Surimi đơng lạnh vào máy đảo trộn Ser N0 92 AP 40 AW. 70 Bibun Corp. Fukuyama Japan) cùng với 2,5% muối, 30% nước đá rồi làm nhuyễn trong 30 phút.
Chuyển m u vào túi poliviniliden clorit, hoặc túi polietilen cĩ đường kính 48 - 50 mm, dài 25 - 30 cm. Buộc 2 đầu túi lại, nhúng m u vào nước ấm nhiệt độ 400C trong 20 phút. Sau đĩ, nhúng m u vào nước nĩng nhiệt độ 90 oC trong 20 phút.
Lấy m u ra và ngâm vào chậu nước cĩ nhiệt độ 20 – 300C để làm nguội. Giữ m u thử ở nhiệt độ trong phịng.
b) Tiến hành thử
- Xác định độ đơng kết c a Surimi trên máy đo Fudoh Rheometer, Model KRM 2002 J. Fudoh Kogyo Co.Ltd. Japan), cĩ đường kính trụ nén 5 mm, độ dài trụ 10 cm. Ch tiến hành thử m u ở nhiệt độ 20 - 30 oC tốt nhất ở 25 oC ).
- Cắt m u thử thành từng khoanh, dày 25 mm và bĩc bỏ màng bọc ngồi.
- Ðặt trụ nén thẳng gĩc với mặt cắt c a m u thử, tăng dần trọng lượng trên bề mặt trụ nén cho tới khi bề mặt m u bị th ng.
- Căn cứ vào đồ thị được vẽ trên máy trong quá trình xác định để tính độ đơng kết c a m u thử. Ðộ đơng kết GS) được tính theo cơng thức :
GS = L.h (g-cm)
Trong đĩ : L : Trọng lượng cần thiết để làm th ng bề mặt m u thử, tính b ng g. h : Ðộ cao khi nén xuống c a mỗi đơn vị đo, tính b ng cm.
13.1.5. Xác định độ dẻo
Ðộ dẻo là mức độ dai và đàn hồi c a sản ph m, cĩ khả năng chịu được tác động c a lực uốn hoặc lực kéo.
Cắt m u thử thành từng lát mỏng 3 mm. Dùng ngĩn tay uốn gập những lát mỏng để xác định độ dẻo.
Mức độ dẻo c a m u thử được đánh giá theo thang điểm 5 bậc quy định trong Bảng.
Bảng : Thang điểm đánh giá độ dẻo của Surimi
Ðiểm Trạng thái mẫu Xếp loại
5 Khơng bị gãy khi gập 2 lần gập đơi rồi lại gập tư )
AA
4 Khơng bị gãy khi gập 1 lần A
3 Xuất hiện sự rạn nứt khi gập 1 lần và để lâu B 2 Xuất hiện sự rạn nứt ngay sau khi gập 1 lần C
1 Bị nứt ngay khi vừa uốn cong D
13.2. Kiểm nghiệm rong biển (TCVN 3590:1988)
13.2.1. Kiểm nghiệm cảm quan
- Màu sắc - Mùi - Vị
- Trạng thái, cấu trúc
13.2.2. Xác định hàm lượng agar – agar
Bước 1: Xử lý rong: Cân 10g rong câu cho vào cốc th y tinh 500ml, đong 250ml nước cất + 6g NaO tinh thể, đảo trộn đều, đặt cốc lên bếp điện, đun 50 phút. Khi đun nhớ nhấn chìm rong cho ngập trong dung dịch kiềm.
Tiếp đĩ gạn dung dịch qua 2 lớp vải màn, dùng nước rửa nhiều lần rửa dưới vịi nước chảy, để yên 5 – 10 phút) rửa cho đến khi p = 7 là được. M u sau khi rửa xong ngâm trong dung dịch axit xitric 0,2% với thể tích 150ml, để ở nhiệt độ phịng, thời gian ngâm là 30 phút. Chú ý nhấn chìm rong ngập trong dung dịch) rồi rửa đến khi p = 7 động tác rửa giống như trên)
Bước 2: Nấu chiết
+ Nấu chiết lần 1: đun sơi 200ml nước cất trong cốc th y tinh 500ml, cho rong đã xử lý vào tiếp tục đun, khi bắt đầu sơi cho vào 1 – 2ml dung dịch C 3COO 10%, đảo đều, tiếp tục đun sơi 20 phút, cho vào 5ml Na2B4O7 4%, lắc đều, đun sơi 15 phút, rồi tiến hành lọc qua 10 lớp vải màn đặt trên phễu. Dung dịch được lọc chứa vào 1 khay men nhỏ, để nguội. Phần bã tiếp tục được nấu chiết lần 2. Dùng nước cất đun sơi tráng vải lọc vài lần, nước tráng cũng