Dựa trên tính chất tạo bọt
Đây chính là tính chất đặc trưng nhất của saponin do phân tử saponin lớn và có cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa trên hiện tượng gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin steroid và trierpenoid: lấy 1g bột nguyên liệu thực vật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thuỷ 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N (pH=1) vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Để yên, nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có bọt cao hơn thì sơ bộ xác định xác định là saponin steroid. Có thể dựa vào chỉ số bọt để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin: chỉ số bọt là số ml nước để hoà tan saponin trong 1g nguyên liệu cho một cột bột cao 1cm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện quy định). Cách tiến hành: cân 1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình nón có thể tích 500ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm và đường kính 16mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3... 10ml nước sắc, thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm cho đủ mỗi ống 10ml. Để yên 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt. Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1cm thì chỉ số bọt dưới 100. Nếu ống có cột bột cao 1cm nằm giữa gam, ví dụ ống số 4 chẳng hạn thì tính như sau: ống này có 4ml nước sắc 1% tương ứng vơi 0,04g bột thì chỉ số là:
10 1 250 0, 04
x =
Nếu chỉ số bọt nằm trong ống số 1,2 thì cần pha loãng để có chỉ số nằm giữa gam.
Dựa trên tính chất phá huyết
Đây cũng là tính chất đặc trưng của saponin. Tuy nhiên cũng có một vài saponin không thể hiện rõ tính chất này. Khả năng phá huyết cũng khác nhau nhiều tuỳ loại saponin. Người ta cho rằng tính phá huyết có liên quan đến sự tạo phức với cholesterol và các ester của nó trong màng hồng cầu nhưng lại thấy rằng giữa chỉ số phá huyết và khả năng tạo phức cholesterol có nhiều trường hợp không tỷ lệ thuận với nhau nên người ta cho rằng phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác nhau của màng hồng cầu. Qua việc theo dõi tính phá huyết của saponin người ta thấy rằng cấu trúc của phần aglycon có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết nhưng phần đường cũng có ảnh hưởng. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị tác động khác nhau đối với một saponin. Hồng cầu cừu dễ bị phá huyết nên dùng tốt, có thể dùng máu của súc vật có sừng khác, hoặc dùng máu thỏ thường dễ kiếm đối với các phòng thí nghiệm.
Để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin, người ta dựa trên chỉ số phá huyết. Cách tiến hành
- Pha dung dịch đệm:
Dung dịch momo kali phosphat 9,07% 28ml Dung dịch dinatri phosphat 11,87% 162ml
NaCl tinh khiết 1,8g
- Pha dung treo máu:
Để làm cho máu không đông thì phải loại fibrin bằng cách lấy 300ml máu súc vật có sừng mới cắt tiết vào bình 1 lít có miệng rộng, dùng đũa quấy tròn đều hoặc cho vào bình một ít bi thuỷ tinh và lắc tròn khoảng 10 phút, lọc qua gạc để loại fibrin, để tủ lạnh có thể dùng được vài ngày. Từ máu đã loại fibrin này đem pha thành dung treo máu 2% với dung dịch đệm. Có thể tiến hành chống đông máu và pha thành dung treo máu để làm thí nghiệm bằng cách khác như sau: lấy 4,5ml máu thỏ trộn với 0,5ml dung dịch 3,65% Natri citrat rồi thêm 220ml dung dịch đêm.
- Pha dung dịch sponin:
Bột nguyên liệu đã rây qua rây 0,5mm, cân chính xác 0,5-1g, cho vào bình, thêm dung dịch đệm (50-100ml) rồi đặt lên nồi cách thuỷ (95-980C) trong 30 phút. Lọc rồi pha đến thể tích chính xác.
- Thử sơ bộ:
Pha các hỗn hợp theo bảng dưới đây:
Ống (ml) I II III IV
y hỗn hợp (tránh tạo bọt). Sau 30 phút, lắc lại rồi để yên trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Quan sát các ống và xác định ống (hoặc các ống) có hiện tượng phá huyết hoàn toàn, nghĩa là ốn
Dung dịch chiết dược liệu 0,10 0,20 0,50 1,00 Dung dịch đệm 0,90 0,80 0,50 - Dung dịch treo máu 2% 1,00 1,00 1,00 1,00
Lắc nhẹ ngag đỏ đều và trong, không có hồng cầu lắng đọng.
Nếu chỉ có ống IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì cứ dùng dung dịch dược liệu ban đầu, nếu ống III và IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì dùng dung dịch đệm pha loãng gấp đôi (1:1), nếu cả 3 ống II, III, IV thì pha loãng gấp 5(1+ 4), nếu cả bốn ống đều trong suốt và đỏ thì pha loãng dịch chiết dược liệu gấp 10 lần (1+ 9) và làm lại thí nghiệm sơ bộ từ đầu. Nếu trường hợp ngược lại, nghĩa là cả 4 ống đều không có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì tiến hành thử sơ bộ lại với dung dịch nguyên liệu đậm đặc hơn.
Thí nghiệm quyết định: lấy 20 ống nghiệm nhỏ (còn gọi là ống phá huyết), đánh số thứ tự rồi cho vào mỗi ống lần lượt như sau: dung dịch chiết nguyên liệu theo thứ tự tăng dần: ống thứ nhất 0,05ml, ống thứ hai 0,10ml...Dung dịch đệm theo thứ tự giảm dần: ống thứ nhất 0,95ml, ống thứ hai 0,90ml... Dung dịch treo máu 25 mỗi ống 1ml. Sau đó lắc khẽ ngay để trộn đều. Sau 30 phút lắc lại I lần nữa. Sau 24 giờ thì đọc kết quả: tìm ống đầu tiên có hiện tượng phá huyết hoàn toàn, tính độ pha loãng của nguyên liệu trong ống đó. Chính độ pha loãng này là chỉ số phá huyết của nguyên liệu. Có thể đọc kết quả sớm hơn bằng cách ly tâm 10 phút (1500 vòng/phút) sau khi đã để yên 2 giờ.
Dựa trên độ độc đối với cá
Cá là động vật rất nhạy cảm với saponin người ta dùng các cây có saponin để thuốc cá (đừng nhầm với rotenon). Để đánh giá nguyên liệu chứa saponin, người ta có thể dựa vào chỉ số cá. Chỉ số cá cũng phải tiến hành trong những điều kiện quy định: môi trường, loại cá...