Luận văn nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ THỊ TÂM TIẾN NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn giúp đỡ trình thực đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trưởng khoa, Phụ trách Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tâp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian cho thực đề tài Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, tập thể Bộ môn Sinh lý thực vật hóa sinh, trường Đại học Khoa học tự nhiên, bảo, giúp đỡ tận tình cho trình thực nghiệm chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Hùng Vương, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Hùng Vương quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho học hoàn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập ii MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC HÌNH VẼ viii BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát acarbose 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose 1.3 Vai trò acarbose 1.3.1 Vai trò acarbose bệnh đái tháo đường 1.3.2 Nghiên cứu tác dụng khác acarbose 1.4 Vai trò Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose 1.4.1 Đại cương Actinoplanes 1.4.2 Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 10 1.4.3 Ứng dụng Actinoplanes sản xuất acarbose 13 1.5 Nghiên cứu hoạt chất acarbose giới 13 1.5.1 Nghiên cứu sản xuất acarbose 13 1.5.2 Nghiên cứu ứng dụng đột biến vi sinh vật .17 1.5.3 Các phương pháp tinh thu nhận acarbose .18 1.5.4 Nghiên cứu sản xuất acarbose nước 21 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 iii .2.1 Vật liệu hóa chất 24 2.1.1 Chủng giống 24 2.1.2 Hóa chất .24 2.1.3 Môi trường 24 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật 26 2.2.2 Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 26 2.2.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy .27 2.2.4 Ảnh hưởng nguồn carbon nitrogen nuôi cấy 27 2.2.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc, nhiệt độ pH nuôi cấy 27 2.3 Gây đột biến NTG 27 2.4 Sắc ký lớp mỏng TLC .28 2.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose 28 2.6 Tách chiết tinh acarbose 29 2.6.1 Tách chiết tinh sơ .29 2.6.2 Tinh acarbose sắc ký cột 29 2.7 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 32 2.8 Sắc ký lỏng ghép khối phổ .32 2.9 Xác định cấu trúc phân tử acarbose cộng hưởng từ hạt nhân 32 iv .2.10 Phương pháp xử lý số liệu 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34 3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy 34 3.2 Tối ưu thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy 37 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian 37 3.2.2 Ảnh hưởng nguồn maltose 39 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn glucose 41 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn bột ngô 43 3.2.5 Ảnh hưởng pH môi trường 45 3.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 47 3.2.7 Ảnh hưởng tốc độ lắc 50 3.2.8 Môi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu 52 3.2.9 Xác định hàm lượng acarbose HPLC .54 3.3 Gây đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 58 3.4 Tinh acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase .61 3.4.1 Chọn lựa phương pháp tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 61 3.4.1.1 Tinh sắc ký hấp thụ silica gel 61 3.4.1.2 Tinh sắc ký lọc gel sephadex G100 62 3.4.1.3 Tinh cột than hoạt tính 62 3.4.2 Chọn lựa phương pháp tinh acarbose từ dịch qua cột than 64 v .3.4.2.1 Tinh sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 64 3.4.2.2 Tinh sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 66 3.4.3 Tinh thu nhận acarbose 68 Như tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 với kết trình bày bảng 3.1 Từ 500 ml dịch lên men với hàm lượng 10,48 mg/ml acarbose, qua bước tinh thu 20 ml dịch acarbose tinh cô đặc có hàm lượng 191,5 mg/ml acarbose Như vậy, hiệu suất thu hồi sau trình tinh đạt 73,1% acarbose 72 3.4.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase 73 3.5 Xác định cấu trúc hóa học acarbose 73 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose 76 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 Kết luận .77 Kiến nghị 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC 85 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 24 Bảng 2.2 Danh sách thiết bị thí nghiệm sử dụng .25 Bảng 2.3 Các môi trường khảo sát nghiên cứu 26 Bảng 3.4 Khối lượng chế phẩm qua bước tinh acarbose 72 vii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học acarbose Hình 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose ruột non Hình 1.3 Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .12 Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường lên men .36 Hình 3.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase môi trường lên men .37 Hình 3.6 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian 38 Hình 3.7 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian 39 Hình 3.8 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nồng độ maltose đến khả sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 41 Hình 3.9 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nồng độ glucose đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 43 Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh viii hưởng nồng độ bột ngô đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 45 Hình 3.11 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 47 Hình 3.12 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 49 Hình 3.13 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 52 Hình 3.14 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường trước sau tối ưu .54 Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 916 môi trường tối ưu 57 Hình 3.16 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 60 Hình 3.17 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 60 Hình 3.18 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men biến thể N217 gây đột biến từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 61 Hình 3.19 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột silica gel 62 Hình 3.20 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên ix men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột sephadex G100 62 Hình 3.21 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột than hoạt tính 64 Hình 3.22 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 66 Hình 3.23 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 67 Hình 3.24 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột than hoạt tính 69 Hình 3.25 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ chuẩn acarbose .70 Hình 3.26 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .71 Hình 3.27 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 72 Hình 3.28 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sau qua cột tinh 73 Hình 3.29 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 74 Hình 3.30 Phổ proton 1H-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .75 Hình 3.31 Cấu trúc phân tử acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 76 Hình 3.32 Qui trình tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 77 x Hà Thị Tâm Tiến OH HO HO Đại học Khoa học tự nhiên OH O N H HO OH OH O HO O OH OH O HO O OH OH Hình 3.31 Cấu trúc phân tử acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose Từ liệu nghiên cứu trên, xây dựng quy trình tách chiết, tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mô phòng thí nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 76 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Dịch lên men (8 ngày) (1) Hòa vào than hoạt tính pH 3, khuấy giờ, để lạnh sau 12 giờ, rửa đến lần nước cất Hỗn hợp than hoạt tính dịch lên men (2) Nhồi lên cột Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 20%) (3) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 15%) (4) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột amberlite XAD 1600T (Hệ dung môi gồm: acetone 10%) (5) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 20% Sắc ký cột amberlite IRA67 (Rửa nước) (6) Dịch acarbose tinh (7) Cô cạn kết tủa methanol acarbose Hình 3.32 Qui trình tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Môi trường điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 77 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Actinoplanes sp KCTC 9161 gồm thành phần (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút thời gian 192 giờ, cho suất đạt 9,98 g/l acarbose tăng gấp 3,4 lần so với trước tối ưu Khả ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh từ Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường tối ưu tăng 5,4% so với môi trường trước tối ưu, đạt 54,2% Đã tạo dòng đột biến N217 từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 có khả sinh tổng hợp acarbose cao, cho suất 10,94 g/l tăng 0,96 g/l so với chủng tự nhiên cho hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose đạt 52,8% tăng gấp 1,35 lần đối chứng Xây dựng quy trình tách chiết, tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính, sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67 Hiệu suất thu hồi acarbose đạt 73,1% Hoạt chất acarbose thu có băng đậm ngang chuẩn sắc ký đồ TLC (Rf = 0,28), có độ tinh 98% Hoạt tính ức chế α-glucosidase dịch acarbose tinh đạt 68,7% tăng 1,6 lần so với dịch lên men Kiến nghị Xây dựng quy trình lên men sản xuất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mô pilot Thử nghiệm, đánh giá chất lượng chế phẩm acarbose tạo ra, định hướng sản xuất thuốc điều trị đái tháo đường type TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 78 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Bộ Y tế (2012), "Dược thư quốc gia Việt Nam 2", Công báo số 119, 1, tr 8-12 Lê Văn Chi (2004), "Tăng đường huyết sau ăn", Tạp chí Thông tin Tim mạch học, 8, tr 37-42 Phạm Hữu Điển (2003), "Một số hợp chất thiên nhiên từ thực vật có tác dụng hạ đường huyết", Tạp chí Dược học, (7), tr 10-12 Nguyễn Lân Dũng (2006), Phân loại xạ khuẩn, Thư viện Học liệu mở Việt Nam, tr 1-11 Vũ Ngọc Lộ (2005), "Những dược liệu có tác dụng hạ đường huyết trị tiểu đường", Tạp chí Dược học, (353), tr 7-9 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Quyền Đình Thi (2013), "Nghiên cứu thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose Actinoplanes sp KCTC 9161" Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 1, tr 403-406 Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương, Đỗ Anh Vũ (2008), "Tác dụng hạ đường huyết dây thìa canh Gymnema sylvestre", Tạp chí Dược học, (391), tr 3133 Công Sơn, Thế Ân (2013), Phòng trị bệnh ung thư, tiểu đường, NXB Hồng Đức, Hà Nội 10 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thị Trang, Lê Thanh Hoàng (2012), "Nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ dòng đột biến Actinoplanes VTCC-A1779", Tạp chí Hóa học, 50(5A), tr 113-116 11 Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh (2011), "Tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase để điều trị bệnh đái tháo đường type 2", Tạp chí Công nghệ sinh học, 9, tr 729-735 12 Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2013), "Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 biến thể", Tạp chí Y học Việt Nam, (2), tr 71-75 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 79 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 13 Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2011), "Sàng lọc số chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp cao chất acarbose có tính ức chế α-glucosidase", Tạp chí Công nghệ sinh học, 9, tr 861-865 Tài liệu tiếng anh 14 Beenken KE, Hawkins AR, Frost JW, Brown KA (2012), "Impact of extracellular nuclease production on the phenotype of Staphylococcus aureus under in vitro and in vivo conditions", Infect Immun, 80(5), pp 1634-1638 15 Bischoff H (1994), "Pharmacology of alpha-glucosidase inhibition", Eur J Clin Invest, 24(3), pp 3-10 16 Blanch M, Calsamiglia S, Devant M, Bach A (2010), "Effects of acarbose on ruminal fermentation, blood metabolites and microbial profile involved in ruminal acidosis in lactating cows fed a high-carbohydrate ration", J Dairy Res, 77, pp 123-128 17 Bock K, Pedersen H (1984), "The solution conformation of acarbose", Carbohydrate Research, (132), pp 142-149 18 Cavalleri B, Pagani H, Volpe G, Selva E, Parenti F (1884), "A new antibiotic from Actinoplanes: fermentation, isolation and prelimilary physico-chemical characteristics", The Journal of Antibiotics, 37(4), pp 309-317 19 Choi BT, Shin CS (2003), "Reduced formation of by product component C in acarbose fermentation by Actinoplanes sp CKD 485-16", Biotechnol Prog, 19, pp 1677-1682 20 Cordero BF, Obraztsova I, Couso I, Leon R, Vargas MA, Rodriguez JF (2011), "Enhancement of lutein production in Chlorella sorokiniana by improvement of cuture conditions and random mutagenesis", MarDrugs, 9(9), pp 16071624 21 Couch JN (1950), "Actinoplanes, a new genus of the actinomycetales", Journal of the Elisha Michell Scientific Society, (66) 22 Dehghan P, Gagari BP (2013), "Efects of high performance inulin supplementation on glucemic status and lipid profile in women with type diabetes: A randomized, Placebo-controlled cilinical trial", Health Promotion Perspectives, 3(1), pp 55-63 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 80 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 23 Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidt D (1979), "New enzyme inhibitors from microorganisms", Planta Med, 35(3), pp 195-217 24 Frommer W, Plus W, Schafer D, Schmidet D (1975), "Glycoside-hydrolase enzyme inhibitors", United States Patent, US 3876766 25 Hayashim T (2008), "The alpha-glucosidase inhibitor acarbose reduces the net electronegative charge of low-density lipoprotein in patients with newly diagnosed type diabetes", Clin Chim Acta, 390, pp 110-114 26 Hemker M, Stratmann A, Goeke K, Schroder W, Lenz JG, Piepersberg W, Paper H (2001), "Identification, cloning, expression and charecterization of the extracellular acarbose-modifying glycotransferase, AcbD from Actinoplanes sp strain SE50", Journal of Bacteriology, 183(15), pp 44844492 27 Hong CL, Kim KH, Choi BT, Choi S, Choi R (2003), "Process for preparing acarbose with high purity", United States Patent, US 6649755B1 28 Hu ZC, Zheng YG (2011), "Enhancement of 1,3-dihydroxyacetone production by a UV-induced mutant of Gluconobacter oxydans with DO control strategy", Appl Microbiol Biotechnol, 165(5-6), pp 1152-1160 29 Huh JH, Kim DJ, Zhao XQ, Li M, Jo YY, Yoon TM (2004), "Widespread activation of antibiotics biosynthesis by S-adenosylmethionine in Streptomycetes", FEMS Microbiol Lett, 238, pp 439-447 30 Jung H, Jeya M, Kim S, Kumar SR, Zhang Y, Lee J (2009), "Biosynthesis, biotechnological production, and application of teicoplanin: current state and perspective", Applied Microbiology and Biotechnology, 84(3), pp 417-428 31 Keri V, Deak L (2002), "Method for purification of acarbose", United States Patent, US 20020183262A1 32 Klein A, Selber K, Wehlmann H, Rosen W, Puhler A, Schwientek P, Kalinowski J, Wehmeier UF (2013), "New Actinomycete intergrative and conjugative element from Actinoplanes sp SE50/110 as plasmid for genetic transformation of related Actinobacteria", International Publication Number, WO 2013/083566 A1 33 Lange PM, Rauenbusch E (1987), "Polymers for the purification of acarbose", Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 81 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên United States Patent, US 4666776 34 Lechevalier H, Lechevalier M (1970), "In the Actinomycetales", Veb G Fisher, pp 393-405 35 Lee JS, Hai T, Paper H, Kim TJ, Suh JW (2008), "Three trehalose synthetic pathways in the acarbose-producing Actinoplanes sp SN223/29 and evidence for the Tre role in biosynthesis of component C", Appl Microbiol Biotechnol, 80(5), pp 767-778 36 Lee S, Saueribrei B, Niggemann J, Egelkraut E (1997), "Biosynthesic studies on the alfa-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp source of the maltose unit", J Antibiot (Tokyo), 50, pp 767-778 37 Lee SS, Egelkrout E (1998), "Studies on the a-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp.: glutamate is the primary source of the nitrogen in acarbose", J Antibiot, 51(11), pp 225-227 38 Li KT, Hou J, Wei SJ, Cheng X (2012), "An optimized industrial fermentation processes for acarbose production by Actinoplanes sp A56", Bioresource Technology, 118, pp 580-583 39 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CH (2007), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 7253278 B2 40 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CS (2005), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 20050118686A1 41 Mahmud T (2003), "The C7N aminocyclitol family of natural products", Nat Prod Rep, 20, pp 137-166 42 Mori Y, Shiozaki M, Matsuura K, Tanaka T, Yokoyama J, Utsunomiya K (2011), "Evaluation of efficacy of acarbose on glucose fluctuation and postprandial glucose using continuous glucose monitoring in type diabetes mellitus", Diabetes Technol Ther, 13, pp 467-470 43 Parenti F, Coronelli C (1979), "Member of the genus Actinoplanes and their antibiotics", Annual Review of Microbiology, 33(1), pp 389-341 44 Parenti F, Pagani H, Beretta G (1975), "Lipiarmycin, a new antibiotic from Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 82 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Actinoplanes", The Journal of Antibiotics, 28(4), pp 247-252 45 Rauenbush E (1990), "Highly pure acarbose", United States Patent, US 4904769 46 Rodriguez JF, Antonio DL, Manuel C, Fatima C (2008), "Application of ion exchange to purify acarbose from fermemtation broths", Biochemical Engineering, 40, pp 130-137 47 Schmidet DD, Frommer W, Junge B, Muller L, Wingender W, Truscheit E, Schafer D (1997), "Alpha-glucosidase inhibitors new complex oligosaccharides of microbial origin", Die Naturwissenschaften, 64(10), pp 535-536 48 Schwientek P (2012), "Genomics and Transcriptomics of the industrial Acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110", Bielefeld University, Germany, 155 pages 49 Schwientek P, Szczepanowski R, Ruckert C, Kalinowski J, Klein A, Selber K, Wehmeier UF, Stoye J, Puhler A (2012), "The complete genome sequence of acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110", BMC Genomic, 13(112), pp 18 pages 50 Shah MM, Cheryan M (1995), "Acetate production by Clostridium thermoaceticum in corn steep liquor media", J Ind Microbiol, 15, pp 424-428 51 Silveira MM, Wisbeck E, Hoch I, Jonas R (2001), "Production of glucose– fructose oxidoreductase and ethanol by Zymomonas mobilis ATCC 29191 in medium containing corn steep liquor as a source of vitamins", Appl Microbiol Biotechnol, 55 52 Sun LH, Li MG, Wang YS, Zheng YG (2012), "Significantly enhanced production of acarbose in fed-batch fermentation with the addition of Sadenosylmethionine", Microbiol Biotechnol, 22, pp 826-831 53 Truscheit E, Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidet D (1981), "Chemistry and biochemistry of microbial a-glucosidase inhibitors", Angjewandte Chemie International Edition in English, 20(9), pp 744-761 54 Tsujino D, Nishimura R, Taki K, Morimoto A, Tajima N, Utsunomiya K (2011), "Comparing the efficacy of α-glucosidase inhibitors in suppressing Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 83 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên postprandial hyperglycemia using continuous glucose monitoring: a pilot study-the major study", Diabetes Technol Ther, 13, pp 303-308 55 Ventura M, Canchaya C, Tauch A, Chandra G, Fitzgerald GF, Chater KF, Van Sinderen D (2007), "Genomics of Actinobacteria: tracing the evolutionary history of an ancient phylum", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(3), pp 495-548 56 Wang Y, Yu L, Zheng YG, Wang YH, Shen YC (2013), "Acarbose isolation with gel type strong acid cation exchange resin: Equilibrium, Kinetic and Thermodynamic studies", ChinJChemEng, 21(10), pp 1106-1113 57 Wang YJ, Dong F, Yu L, Zheng YG (2012a), "Study on acarbose adsorption performance of cation exchanger SAC 001x7", ChinJChemEng, (3), pp 493498 58 Wang YJ, Liu LL, Feng ZH, Liu ZQ, Zheng YG (2011), "Optimization of media composition and culture conditions for acarbose production by Actinoplanes utahensis ZJB-08196", Microbiol Biotechnol, 27, pp 2759-2766 59 Wang YJ, Liu LL, Wang YS, Xue YP, Zheng YG, Shen YC (2012b), "Actinoplanes utahensis ZJB-08196 fed-batch fermentation at elevated osmolality for enhancing acarbose production", Bioresource Technology, 103, pp 337-342 60 Wehmeier UF (2003), "The biosynthesis and metabolism of acarbose in Actinoplanes sp SE 50/110", Biocatalysis and biotransformation, 21(4-5), pp 279-284 61 Wei SJ, Cheng X, Huang L, Li KT (2010), "Medium optimization for acarbose production by Actinoplanes sp A56 using the response surface methodology", African Journal of Biotechnology, 9, pp 1849-1854 62 Whistler RL, Durso DF (1949), "Chromatographic Separation of Sugar on Charcoal", Purdue University, 72, pp 667-679 63 Xue YP, Qin JW, Wang YJ, Wang YS, Zheng YG (2013), "Enhanced production of acarbose and concurrently reduced formation of impurity C by addition of validaminein fermentation of Actinoplanes utahensis ZJB-08196", BioMed Research International, pages Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 84 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 64 Yamaki K, Mori Y (2006), "Evaluation of α-glucosidase inhibitory activity in colored foods : a trial using slope factors of regression curves", Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 53(4), pp 229-231 PHỤ LỤC Bảng P1 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường lựa chọn Môi trường MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 Lần 50,9 42,3 51,0 49,2 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 52,7 53,1 52,2 ± 1,2 47,1 45,8 45,1 ± 2,5 0 43,8 46,0 46,6 ± 4,1 51,0 53,0 51,0 ± 1,9 Bảng P2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 85 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Thời gian (giờ) 48-72 96 120 144 168 192 216 Lần Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 19,1 36,8 51,9 51,8 57,3 56,6 15,9 35,9 44,7 47,3 52,5 48,4 20,8 41,1 42,0 51,7 55,8 51,7 18,6 ± 2,5 38,0 ± 2,9 46,2 ± 5,1 50,3 ± 2,6 55,2 ± 2,4 52,2 ± 4,1 Bảng P3 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ maltose Nồng độ maltose (g/l) 20 30 40 50 60 Lần Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 39,0 50,8 54,7 54,8 50,1 35,2 48,5 47,7 50,4 50,3 35,6 47,7 46,8 50,4 47,2 36,6 ± 2,1 49,0 ± 1,6 49,7 ± 4,3 51,9 ± 2,5 49,2 ± 1,7 Bảng P4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ glucose Nồng độ glucose (g/l) 10 20 30 40 50 Lần Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 28,1 29,2 41,0 42,5 43,8 27,7 34,6 42,7 44,1 43,9 32,1 33,8 45,6 44,0 45,5 29,3 ± 2,4 32,6 ± 2,9 43,1 ± 2,3 43,5 ± 0,9 44,4 ± 1,0 Bảng P5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ bột ngô Nồng độ bột ngô (g/l) 10 15 20 25 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình 24,7 26,1 50,9 55,3 48,2 47,5 24,2 34,1 50,2 56,0 48,4 47,7 26,4 31,4 45,5 52,2 52,7 48,9 25,1 ± 1,1 30,6 ± 4,0 48,9 ± 2,9 54,5 ± 2,0 49,8 ± 2,5 48,0 ± 0,8 Bảng P6 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo giá trị pH môi trường Giá trị pH môi trường Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Lần Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 86 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 39,6 43,3 42,9 29,4 31,9 31,9 35,6 46,4 39,6 35,7 29,2 30,3 40,1 44,8 40,3 32,4 34,1 30,7 38,4 ± 2,4 44,8 ± 1,5 40,9 ± 1,7 32,5 ± 3,2 31,7 ± 2,4 31,0 ± 0,8 Bảng P7 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy (oC) 25 28 30 37 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình 48,3 40,3 39,4 41,0 47,2 45,1 47,2 46,1 46,8 43,3 44,4 43,7 47,5 ± 0,7 42,9 ± 2,4 43,7 ± 3,9 43,6 ± 2,6 Bảng P8 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo tốc độ lắc nuôi cấy Tốc độ lắc (vòng/phút) 100 150 200 220 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình 42,6 47,8 47,3 46,0 41,0 45,6 47,3 40,1 45,5 48,3 44,5 43,7 43,0 ± 2,3 47,3 ± 1,4 46,4 ± 1,6 43,3 ± 3,0 Bảng P9 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 trước sau tối ưu Môi trường ưu Trước Sau Lần 48,5 53,3 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 49,5 48,5 48,8 ± 0,6 53,7 55,5 54,2 ± 1,2 Bảng P10 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Mẫu Dịch lên men Cột than Cột amberlite IRA 400 Cột DEAE-sepharose Cột than Dịch tinh Lần 39,3 16,7 22,1 33,7 57,1 68,0 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 46,1 43,2 42,9 ± 3,4 17,5 15,2 16,5 ± 1,2 18,4 20,5 20,3 ± 1,9 28,9 28,3 30,3 ± 3,0 57,9 59,1 58,0 ± 1,0 67,9 70,2 68,7 ± 1,3 Bảng P11 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men dòng đột Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 87 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên biến từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Dòng đột biến Ký hiệu ĐC 10 11 12 13 14 15 TN N211 N212 N213 N214 N215 N216 N217 N111 N112 N121 N122 N123 N124 N125 N311 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình 39,8 38,9 39,0 39,2 ± 0,5 40,1 42,4 40,2 40,9 ± 1,3 36,5 37,8 37,9 37,4 ± 0,8 50,9 50,9 50,2 50,7 ± 0,4 49,4 49,7 50,0 49,7 ± 0,3 46,4 48,8 47,6 47,6 ± 1,2 47,9 48,6 51,7 49,4 ± 2,0 52,0 53,3 53,0 52,8 ± 0,7 49,7 49,7 48,8 49,4 ± 0,5 50,4 53,4 47,7 50,5 ± 2,9 51,4 51,0 48,9 50,4 ± 1,3 40,1 41,4 41,6 41,1 ± 0,9 40,8 37,9 35,2 38,0 ± 2,8 39,8 37,8 43,0 40,2 ± 2,6 42,7 41,4 39,7 41,3 ± 1,5 49,4 52,2 50,4 50,7 ± 1,4 88 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Hình P1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân COSY mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 89 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Hình P2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13CPD DEPT mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Hình P3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC HSQC mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 90