Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ THỊ TÂM TIẾN NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2013 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội - 2013 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn giúp đỡ trình thực đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trưởng khoa, Phụ trách Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tâp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian cho thực đề tài Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, tập thể Bộ môn Sinh lý thực vật hóa sinh, trường Đại học Khoa học tự nhiên, bảo, giúp đỡ tận tình cho trình thực nghiệm chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Hùng Vương, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Hùng Vương quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho học hoàn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Học viên Hà Thị Tâm Tiến iii MỤC LỤC MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC HÌNH VẼ ix BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát acarbose 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose 1.3 Vai trò acarbose 1.3.1 Vai trò acarbose bệnh đái tháo đường 1.3.2 Nghiên cứu tác dụng khác acarbose 1.4 Vai trò Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose 1.4.1 Đại cương Actinoplanes 1.4.2 Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 1.4.3 Ứng dụng Actinoplanes sản xuất acarbose 11 1.5 Nghiên cứu hoạt chất acarbose giới 12 1.5.1 Nghiên cứu sản xuất acarbose 12 1.5.2 Nghiên cứu ứng dụng đột biến vi sinh vật .16 1.5.3 Các phương pháp tinh thu nhận acarbose .17 1.5.4 Nghiên cứu sản xuất acarbose nước 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 iv .2.1 Vật liệu hóa chất 22 2.1.1 Chủng giống 22 2.1.2 Hóa chất .22 2.1.3 Môi trường 23 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật 24 2.2.2 Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 24 2.2.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy .25 2.2.4 Ảnh hưởng nguồn carbon nitrogen nuôi cấy 25 2.2.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc, nhiệt độ pH nuôi cấy 25 2.3 Gây đột biến NTG 26 2.4 Sắc ký lớp mỏng TLC .26 2.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose 27 2.6 Tách chiết tinh acarbose 27 2.6.1 Tách chiết tinh sơ .27 2.6.2 Tinh acarbose sắc ký cột 28 2.7 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 30 2.8 Sắc ký lỏng ghép khối phổ .30 2.9 Xác định cấu trúc phân tử acarbose cộng hưởng từ hạt nhân 30 v .2.10 Phương pháp xử lý số liệu 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .32 3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy 32 3.2 Tối ưu thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy 34 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian 34 3.2.2 Ảnh hưởng nguồn maltose 36 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn glucose 37 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn bột ngô 39 3.2.5 Ảnh hưởng pH môi trường 40 3.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 41 3.2.7 Ảnh hưởng tốc độ lắc 42 3.2.8 Môi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu 43 3.2.9 Xác định hàm lượng acarbose HPLC .44 3.3 Gây đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 46 3.4 Tinh acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase .48 3.4.1 Chọn lựa phương pháp tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 48 3.4.1.1 Tinh sắc ký hấp thụ silica gel 48 3.4.1.2 Tinh sắc ký lọc gel sephadex G100 49 3.4.1.3 Tinh cột than hoạt tính 50 3.4.2 Chọn lựa phương pháp tinh acarbose từ dịch qua cột than 51 vi .3.4.2.1 Tinh sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 51 3.4.2.2 Tinh sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 51 3.4.3 Tinh thu nhận acarbose 52 Như tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 với kết trình bày bảng 3.1 Từ 500 ml dịch lên men với hàm lượng 10,48 mg/ml acarbose, qua bước tinh thu 20 ml dịch acarbose tinh cô đặc có hàm lượng 191,5 mg/ml acarbose Như vậy, hiệu suất thu hồi sau trình tinh đạt 73,1% acarbose 56 3.4.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase 56 3.5 Xác định cấu trúc hóa học acarbose 57 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 Kết luận .61 Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 68 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 23 Bảng 2.2 Danh sách thiết bị thí nghiệm sử dụng .23 Bảng 2.3 Các môi trường khảo sát nghiên cứu 24 Bảng 3.4 Khối lượng chế phẩm qua bước tinh acarbose 56 viii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học acarbose Hình 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose ruột non Hình 1.3 Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .11 Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường lên men .32 Hình 3.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase môi trường lên men .33 Hình 3.6 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian 34 Hình 3.7 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian 35 Hình 3.8 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nồng độ maltose đến khả sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 36 Hình 3.9 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nồng độ glucose đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 38 ix Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nồng độ bột ngô đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 39 Hình 3.11 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 40 Hình 3.12 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 42 Hình 3.13 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 42 Hình 3.14 Sắc ký đồ TLC (a) hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường trước sau tối ưu .43 Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 916 môi trường tối ưu 45 Hình 3.16 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 47 Hình 3.17 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ dòng đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 47 Hình 3.18 Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men biến thể N217 gây đột biến từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 48 Hình 3.19 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột silica gel 49 x Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên cho phép dự đoán cấu trúc hợp chất tinh acarbose Khi so sánh liệu phổ với liệu phổ acarbose công bố cho phép khẳng định hợp chất tinh acarbose có công thức phân tử C 25H43NO18 có cấu trúc hình 3.28 OH HO HO OH O N H HO OH OH O HO O OH OH O HO O OH OH Hình 3.31 Cấu trúc phân tử acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 59 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose Từ liệu nghiên cứu trên, xây dựng quy trình tách chiết, tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mô phòng thí nghiệm Dịch lên men (8 ngày) (1) Hòa vào than hoạt tính pH 3, khuấy giờ, để lạnh sau 12 giờ, rửa đến lần nước cất Hỗn hợp than hoạt tính dịch lên men (2) Nhồi lên cột Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 20%) (3) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 15%) (4) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột amberlite XAD 1600T (Hệ dung môi gồm: acetone 10%) (5) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 20% Sắc ký cột amberlite IRA67 (Rửa nước) (6) Dịch acarbose tinh (7) Cô cạn kết tủa methanol acarbose Hình 3.32 Qui trình tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 60 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Môi trường điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 gồm thành phần (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút thời gian 192 giờ, cho suất đạt 9,98 g/l acarbose tăng gấp 3,4 lần so với trước tối ưu Khả ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh từ Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường tối ưu tăng 5,4% so với môi trường trước tối ưu, đạt 54,2% Đã tạo dòng đột biến N217 từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 có khả sinh tổng hợp acarbose cao, cho suất 10,94 g/l tăng 0,96 g/l so với chủng tự nhiên cho hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose đạt 52,8% tăng gấp 1,35 lần đối chứng Xây dựng quy trình tách chiết, tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính, sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67 Hiệu suất thu hồi acarbose đạt 73,1% Hoạt chất acarbose thu có băng đậm ngang chuẩn sắc ký đồ TLC (Rf = 0,28), có độ tinh 98% Hoạt tính ức chế α-glucosidase dịch acarbose tinh đạt 68,7% tăng 1,6 lần so với dịch lên men Kiến nghị Xây dựng quy trình lên men sản xuất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mô pilot Thử nghiệm, đánh giá chất lượng chế phẩm acarbose tạo ra, định hướng sản xuất thuốc điều trị đái tháo đường type Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 61 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ Y tế (2012), "Dược thư quốc gia Việt Nam 2", Công báo số 119, 1, tr 8-12 Lê Văn Chi (2004), "Tăng đường huyết sau ăn", Tạp chí Thông tin Tim mạch học, 8, tr 37-42 Phạm Hữu Điển (2003), "Một số hợp chất thiên nhiên từ thực vật có tác dụng hạ đường huyết", Tạp chí Dược học, (7), tr 10-12 Nguyễn Lân Dũng (2006), Phân loại xạ khuẩn, Thư viện Học liệu mở Việt Nam, tr 1-11 Vũ Ngọc Lộ (2005), "Những dược liệu có tác dụng hạ đường huyết trị tiểu đường", Tạp chí Dược học, (353), tr 7-9 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Quyền Đình Thi (2013), "Nghiên cứu thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose Actinoplanes sp KCTC 9161" Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 1, tr 403-406 Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương, Đỗ Anh Vũ (2008), "Tác dụng hạ đường huyết dây thìa canh Gymnema sylvestre", Tạp chí Dược học, (391), tr 3133 Công Sơn, Thế Ân (2013), Phòng trị bệnh ung thư, tiểu đường, NXB Hồng Đức, Hà Nội 10 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thị Trang, Lê Thanh Hoàng (2012), "Nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ dòng đột biến Actinoplanes VTCC-A1779", Tạp chí Hóa học, 50(5A), tr 113-116 11 Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh (2011), "Tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase để điều trị bệnh đái tháo đường type 2", Tạp chí Công nghệ sinh học, 9, tr 729-735 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 62 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 12 Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2013), "Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 biến thể", Tạp chí Y học Việt Nam, (2), tr 71-75 13 Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2011), "Sàng lọc số chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp cao chất acarbose có tính ức chế α-glucosidase", Tạp chí Công nghệ sinh học, 9, tr 861-865 Tài liệu tiếng anh 14 Beenken KE, Hawkins AR, Frost JW, Brown KA (2012), "Impact of extracellular nuclease production on the phenotype of Staphylococcus aureus under in vitro and in vivo conditions", Infect Immun, 80(5), pp 1634-1638 15 Bischoff H (1994), "Pharmacology of alpha-glucosidase inhibition", Eur J Clin Invest, 24(3), pp 3-10 16 Blanch M, Calsamiglia S, Devant M, Bach A (2010), "Effects of acarbose on ruminal fermentation, blood metabolites and microbial profile involved in ruminal acidosis in lactating cows fed a high-carbohydrate ration", J Dairy Res, 77, pp 123-128 17 Bock K, Pedersen H (1984), "The solution conformation of acarbose", Carbohydrate Research, (132), pp 142-149 18 Cavalleri B, Pagani H, Volpe G, Selva E, Parenti F (1884), "A new antibiotic from Actinoplanes: fermentation, isolation and prelimilary physico-chemical characteristics", The Journal of Antibiotics, 37(4), pp 309-317 19 Choi BT, Shin CS (2003), "Reduced formation of by product component C in acarbose fermentation by Actinoplanes sp CKD 485-16", Biotechnol Prog, 19, pp 1677-1682 20 Cordero BF, Obraztsova I, Couso I, Leon R, Vargas MA, Rodriguez JF (2011), "Enhancement of lutein production in Chlorella sorokiniana by improvement of cuture conditions and random mutagenesis", MarDrugs, 9(9), pp 16071624 21 Couch JN (1950), "Actinoplanes, a new genus of the actinomycetales", Journal of the Elisha Michell Scientific Society, (66) Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 63 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 22 Dehghan P, Gagari BP (2013), "Efects of high performance inulin supplementation on glucemic status and lipid profile in women with type diabetes: A randomized, Placebo-controlled cilinical trial", Health Promotion Perspectives, 3(1), pp 55-63 23 Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidt D (1979), "New enzyme inhibitors from microorganisms", Planta Med, 35(3), pp 195-217 24 Frommer W, Plus W, Schafer D, Schmidet D (1975), "Glycoside-hydrolase enzyme inhibitors", United States Patent, US 3876766 25 Hayashim T (2008), "The alpha-glucosidase inhibitor acarbose reduces the net electronegative charge of low-density lipoprotein in patients with newly diagnosed type diabetes", Clin Chim Acta, 390, pp 110-114 26 Hemker M, Stratmann A, Goeke K, Schroder W, Lenz JG, Piepersberg W, Paper H (2001), "Identification, cloning, expression and charecterization of the extracellular acarbose-modifying glycotransferase, AcbD from Actinoplanes sp strain SE50", Journal of Bacteriology, 183(15), pp 44844492 27 Hong CL, Kim KH, Choi BT, Choi S, Choi R (2003), "Process for preparing acarbose with high purity", United States Patent, US 6649755B1 28 Hu ZC, Zheng YG (2011), "Enhancement of 1,3-dihydroxyacetone production by a UV-induced mutant of Gluconobacter oxydans with DO control strategy", Appl Microbiol Biotechnol, 165(5-6), pp 1152-1160 29 Huh JH, Kim DJ, Zhao XQ, Li M, Jo YY, Yoon TM (2004), "Widespread activation of antibiotics biosynthesis by S-adenosylmethionine in Streptomycetes", FEMS Microbiol Lett, 238, pp 439-447 30 Jung H, Jeya M, Kim S, Kumar SR, Zhang Y, Lee J (2009), "Biosynthesis, biotechnological production, and application of teicoplanin: current state and perspective", Applied Microbiology and Biotechnology, 84(3), pp 417-428 31 Keri V, Deak L (2002), "Method for purification of acarbose", United States Patent, US 20020183262A1 32 Klein A, Selber K, Wehlmann H, Rosen W, Puhler A, Schwientek P, Kalinowski J, Wehmeier UF (2013), "New Actinomycete intergrative and Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 64 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên conjugative element from Actinoplanes sp SE50/110 as plasmid for genetic transformation of related Actinobacteria", International Publication Number, WO 2013/083566 A1 33 Lange PM, Rauenbusch E (1987), "Polymers for the purification of acarbose", United States Patent, US 4666776 34 Lechevalier H, Lechevalier M (1970), "In the Actinomycetales", Veb G Fisher, pp 393-405 35 Lee JS, Hai T, Paper H, Kim TJ, Suh JW (2008), "Three trehalose synthetic pathways in the acarbose-producing Actinoplanes sp SN223/29 and evidence for the Tre role in biosynthesis of component C", Appl Microbiol Biotechnol, 80(5), pp 767-778 36 Lee S, Saueribrei B, Niggemann J, Egelkraut E (1997), "Biosynthesic studies on the alfa-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp source of the maltose unit", J Antibiot (Tokyo), 50, pp 767-778 37 Lee SS, Egelkrout E (1998), "Studies on the a-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp.: glutamate is the primary source of the nitrogen in acarbose", J Antibiot, 51(11), pp 225-227 38 Li KT, Hou J, Wei SJ, Cheng X (2012), "An optimized industrial fermentation processes for acarbose production by Actinoplanes sp A56", Bioresource Technology, 118, pp 580-583 39 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CH (2007), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 7253278 B2 40 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CS (2005), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 20050118686A1 41 Mahmud T (2003), "The C7N aminocyclitol family of natural products", Nat Prod Rep, 20, pp 137-166 42 Mori Y, Shiozaki M, Matsuura K, Tanaka T, Yokoyama J, Utsunomiya K (2011), "Evaluation of efficacy of acarbose on glucose fluctuation and postprandial glucose using continuous glucose monitoring in type diabetes mellitus", Diabetes Technol Ther, 13, pp 467-470 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 65 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 43 Parenti F, Coronelli C (1979), "Member of the genus Actinoplanes and their antibiotics", Annual Review of Microbiology, 33(1), pp 389-341 44 Parenti F, Pagani H, Beretta G (1975), "Lipiarmycin, a new antibiotic from Actinoplanes", The Journal of Antibiotics, 28(4), pp 247-252 45 Rauenbush E (1990), "Highly pure acarbose", United States Patent, US 4904769 46 Rodriguez JF, Antonio DL, Manuel C, Fatima C (2008), "Application of ion exchange to purify acarbose from fermemtation broths", Biochemical Engineering, 40, pp 130-137 47 Schmidet DD, Frommer W, Junge B, Muller L, Wingender W, Truscheit E, Schafer D (1997), "Alpha-glucosidase inhibitors new complex oligosaccharides of microbial origin", Die Naturwissenschaften, 64(10), pp 535-536 48 Schwientek P (2012), "Genomics and Transcriptomics of the industrial Acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110", Bielefeld University, Germany, 155 pages 49 Schwientek P, Szczepanowski R, Ruckert C, Kalinowski J, Klein A, Selber K, Wehmeier UF, Stoye J, Puhler A (2012), "The complete genome sequence of acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110", BMC Genomic, 13(112), pp 18 pages 50 Shah MM, Cheryan M (1995), "Acetate production by Clostridium thermoaceticum in corn steep liquor media", J Ind Microbiol, 15, pp 424-428 51 Silveira MM, Wisbeck E, Hoch I, Jonas R (2001), "Production of glucose– fructose oxidoreductase and ethanol by Zymomonas mobilis ATCC 29191 in medium containing corn steep liquor as a source of vitamins", Appl Microbiol Biotechnol, 55 52 Sun LH, Li MG, Wang YS, Zheng YG (2012), "Significantly enhanced production of acarbose in fed-batch fermentation with the addition of Sadenosylmethionine", Microbiol Biotechnol, 22, pp 826-831 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 66 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 53 Truscheit E, Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidet D (1981), "Chemistry and biochemistry of microbial a-glucosidase inhibitors", Angjewandte Chemie International Edition in English, 20(9), pp 744-761 54 Tsujino D, Nishimura R, Taki K, Morimoto A, Tajima N, Utsunomiya K (2011), "Comparing the efficacy of α-glucosidase inhibitors in suppressing postprandial hyperglycemia using continuous glucose monitoring: a pilot study-the major study", Diabetes Technol Ther, 13, pp 303-308 55 Ventura M, Canchaya C, Tauch A, Chandra G, Fitzgerald GF, Chater KF, Van Sinderen D (2007), "Genomics of Actinobacteria: tracing the evolutionary history of an ancient phylum", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(3), pp 495-548 56 Wang Y, Yu L, Zheng YG, Wang YH, Shen YC (2013), "Acarbose isolation with gel type strong acid cation exchange resin: Equilibrium, Kinetic and Thermodynamic studies", ChinJChemEng, 21(10), pp 1106-1113 57 Wang YJ, Dong F, Yu L, Zheng YG (2012a), "Study on acarbose adsorption performance of cation exchanger SAC 001x7", ChinJChemEng, (3), pp 493498 58 Wang YJ, Liu LL, Feng ZH, Liu ZQ, Zheng YG (2011), "Optimization of media composition and culture conditions for acarbose production by Actinoplanes utahensis ZJB-08196", Microbiol Biotechnol, 27, pp 2759-2766 59 Wang YJ, Liu LL, Wang YS, Xue YP, Zheng YG, Shen YC (2012b), "Actinoplanes utahensis ZJB-08196 fed-batch fermentation at elevated osmolality for enhancing acarbose production", Bioresource Technology, 103, pp 337-342 60 Wehmeier UF (2003), "The biosynthesis and metabolism of acarbose in Actinoplanes sp SE 50/110", Biocatalysis and biotransformation, 21(4-5), pp 279-284 61 Wei SJ, Cheng X, Huang L, Li KT (2010), "Medium optimization for acarbose production by Actinoplanes sp A56 using the response surface methodology", African Journal of Biotechnology, 9, pp 1849-1854 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 67 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 62 Whistler RL, Durso DF (1949), "Chromatographic Separation of Sugar on Charcoal", Purdue University, 72, pp 667-679 63 Xue YP, Qin JW, Wang YJ, Wang YS, Zheng YG (2013), "Enhanced production of acarbose and concurrently reduced formation of impurity C by addition of validaminein fermentation of Actinoplanes utahensis ZJB-08196", BioMed Research International, pages 64 Yamaki K, Mori Y (2006), "Evaluation of α-glucosidase inhibitory activity in colored foods : a trial using slope factors of regression curves", Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 53(4), pp 229-231 PHỤ LỤC Bảng P1 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường lựa chọn Môi trường Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Ức chế α-glucosidase (%) 68 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 Lần 50,9 42,3 51,0 49,2 Lần 52,7 47,1 43,8 51,0 Lần 53,1 45,8 46,0 53,0 Trung bình 52,2 ± 1,2 45,1 ± 2,5 46,6 ± 4,1 51,0 ± 1,9 Bảng P2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo thời gian Thời gian (giờ) 48-72 96 120 144 168 192 216 Lần Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 19,1 36,8 51,9 51,8 57,3 56,6 15,9 35,9 44,7 47,3 52,5 48,4 20,8 41,1 42,0 51,7 55,8 51,7 18,6 ± 2,5 38,0 ± 2,9 46,2 ± 5,1 50,3 ± 2,6 55,2 ± 2,4 52,2 ± 4,1 Bảng P3 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ maltose Nồng độ maltose (g/l) 20 30 40 50 60 Lần 39,0 50,8 54,7 54,8 50,1 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 35,2 48,5 47,7 50,4 50,3 35,6 47,7 46,8 50,4 47,2 36,6 ± 2,1 49,0 ± 1,6 49,7 ± 4,3 51,9 ± 2,5 49,2 ± 1,7 Bảng P4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ glucose Nồng độ glucose (g/l) 10 20 30 40 50 Lần 28,1 29,2 41,0 42,5 43,8 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 27,7 34,6 42,7 44,1 43,9 32,1 33,8 45,6 44,0 45,5 29,3 ± 2,4 32,6 ± 2,9 43,1 ± 2,3 43,5 ± 0,9 44,4 ± 1,0 Bảng P5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nồng độ bột ngô Nồng độ bột ngô (g/l) Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 24,7 26,1 24,2 34,1 69 26,4 31,4 25,1 ± 1,1 30,6 ± 4,0 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 10 15 20 25 50,9 55,3 48,2 47,5 50,2 56,0 48,4 47,7 45,5 52,2 52,7 48,9 48,9 ± 2,9 54,5 ± 2,0 49,8 ± 2,5 48,0 ± 0,8 Bảng P6 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo giá trị pH môi trường Giá trị pH môi trường Lần 39,6 43,3 42,9 29,4 31,9 31,9 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 35,6 40,1 38,4 ± 2,4 46,4 44,8 44,8 ± 1,5 39,6 40,3 40,9 ± 1,7 35,7 32,4 32,5 ± 3,2 29,2 34,1 31,7 ± 2,4 30,3 30,7 31,0 ± 0,8 Bảng P7 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy (oC) 25 28 30 37 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình 48,3 40,3 39,4 41,0 47,2 45,1 47,2 46,1 46,8 43,3 44,4 43,7 47,5 ± 0,7 42,9 ± 2,4 43,7 ± 3,9 43,6 ± 2,6 Bảng P8 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 theo tốc độ lắc nuôi cấy Tốc độ lắc (vòng/phút) 100 150 200 220 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình 42,6 47,8 47,3 46,0 41,0 45,6 47,3 40,1 45,5 48,3 44,5 43,7 43,0 ± 2,3 47,3 ± 1,4 46,4 ± 1,6 43,3 ± 3,0 Bảng P9 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 trước sau tối ưu Môi trường ưu Trước Sau Lần 48,5 53,3 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 49,5 48,5 48,8 ± 0,6 53,7 55,5 54,2 ± 1,2 Bảng P10 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 70 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Mẫu Dịch lên men Cột than Cột amberlite IRA 400 Cột DEAE-sepharose Cột than Dịch tinh Lần 39,3 16,7 22,1 33,7 57,1 68,0 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Trung bình 46,1 43,2 42,9 ± 3,4 17,5 15,2 16,5 ± 1,2 18,4 20,5 20,3 ± 1,9 28,9 28,3 30,3 ± 3,0 57,9 59,1 58,0 ± 1,0 67,9 70,2 68,7 ± 1,3 Bảng P11 Hoạt tính ức chế α-glucosidase mẫu acarbose từ dịch lên men dòng đột biến từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Dòng đột biến Ký hiệu ĐC 10 11 12 13 14 15 TN N211 N212 N213 N214 N215 N216 N217 N111 N112 N121 N122 N123 N124 N125 N311 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Ức chế α-glucosidase (%) Lần Lần Lần Trung bình 39,8 38,9 39,0 39,2 ± 0,5 40,1 42,4 40,2 40,9 ± 1,3 36,5 37,8 37,9 37,4 ± 0,8 50,9 50,9 50,2 50,7 ± 0,4 49,4 49,7 50,0 49,7 ± 0,3 46,4 48,8 47,6 47,6 ± 1,2 47,9 48,6 51,7 49,4 ± 2,0 52,0 53,3 53,0 52,8 ± 0,7 49,7 49,7 48,8 49,4 ± 0,5 50,4 53,4 47,7 50,5 ± 2,9 51,4 51,0 48,9 50,4 ± 1,3 40,1 41,4 41,6 41,1 ± 0,9 40,8 37,9 35,2 38,0 ± 2,8 39,8 37,8 43,0 40,2 ± 2,6 42,7 41,4 39,7 41,3 ± 1,5 49,4 52,2 50,4 50,7 ± 1,4 71 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Hình P1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân COSY mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Hình P2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13CPD DEPT mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 72 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Hình P3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC HSQC mẫu acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 73 [...]... acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 55 Hình 3.28 Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sau khi qua các cột tinh sạch 56 Hình 3.29 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 57 Hình 3.30 Phổ proton 1H-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ. .. từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 .58 Hình 3.31 Cấu trúc phân tử acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 59 xi Hình 3.32 Qui trình tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 60 BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT 13 C-NMR Carbon-13, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy H-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon... Tuyên và cs (2011) đã nghiên cứu sàng lọc trên một số chủng Actinoplanes sp VTCC được cung cấp bởi Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam (VTCC), nhằm lựa chọn được chủng cho khả năng sinh tổng hợp acarbose cao Kết quả từ 12 chủng Actinoplanes sp nghiên cứu đã lựa chọn được 6 chủng sinh tổng hợp acarbose cao dựa trên sắc ký đồ TLC và hoạt tính ức chế αglucosidase Môi trường thích hợp cho lên men sinh. .. sp KCTC 9161 cho thấy: Môi trường thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 bao gồm (g/l): 30 maltose, 30 glucose, 10 bột ngô, 1 sodium glutamate, 2 CaCl2, 0,5 FeCl3, 1 K2HPO4, 2,5 CaCO3, pH = 7,0 Thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp acarbose cao ở 168 giờ, 28°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao. .. (2011) đã tiến hành nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ các dòng đột biến Actinoplanes sp VTCC-A1779 Kết quả cho thấy, từ 60 dòng đột biến, đã chọn được 6 dòng sinh tổng hợp acarbose cao hơn chủng gốc và 6 dòng có hoạt tính ức chế α-glucosidase trên 60% Trong đó 2 dòng sinh tổng hợp acarbose cao nhất là dòng 37 (đột biến nồng độ NTG 0,3 M, 120 phút) ức chế 68% hoạt tính α-glucosidase và dòng 43 (ở nồng... acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 và 2 dòng đột biến A242, A313 Các chủng dòng Actinoplanes sp sinh trưởng tốt nhất và ổn định nhất khi bảo quản ở -80°C Sinh tổng hợp acarbose đều ổn định sau khi bảo quản ở 4°C, -20°C, với hoạt tính ức chế α-glucosidase ổn định so với chủng gốc Nguyễn Thị Nương và cs (2013) khi tối ưu thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. .. mới và cấp thiết Việc sản xuất acarbose từ xạ khuẩn Actinoplanes sẽ mang lại hiệu quả kinh tế, sản xuất nhanh, chủ động, giá thành thấp do sử dụng nguồn nguyên liệu dễ kiếm Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 trong khuân khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose. .. đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 khi qua cột sephadex G100 49 Hình 3.21 Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 khi qua cột than hoạt tính 1 50 Hình 3.22 Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 51 Hình 3.23 Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch. .. ức chế α-glucosidase Sau này một chủng tự nhiên Actinoplanes sp SE50 khác được phân lập gọi là Actinoplanes sp SE50/110 (Actinoplanes sp KCTC 9161) đã sản xuất acarbose lên tới 1 g/l và từ đó chủng này được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu về gene sinh tổng hợp acarbose, chức năng mã hóa enzyme của nó Cụm gene (acb) sinh tổng hợp acarbose trong Actinoplanes sp SE50/110 đã được xác định trình... 28oC Năng suất sinh tổng hợp acarbose đạt 1043 mg/l tăng 24,61% so với trước khi tối ưu Wang và cs (2011) đã tối ưu môi trường sinh tổng hợp acarbose của chủng A utahensis ZJB-08196 (là một dòng đột biến từ chủng Actinoplanes sp ZJB005) Kết quả tối ưu cho thấy, maltose, glycerol và monosodium glutamate trong môi trường làm tăng khả năng sinh tổng hợp acarbose Bột ngô có vai trò cao trong sự sinh trưởng