Untitled i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, trƣớc hết tôi xin gửi đến cô TS nguyễn Nhƣ Ngọc, TS Trần Thị Thu Lan lời cảm ơn sâu sắc, ngƣời đã giúp đỡ tận tình hƣớng dẫn và theo[.]
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, trƣớc hết xin gửi đến cô - TS nguyễn Nhƣ Ngọc, TS Trần Thị Thu Lan lời cảm ơn sâu sắc, ngƣời giúp đỡ tận tình hƣớng dẫn theo dõi sát tơi q trình hồn thiện nghiên cứu Tơi xin gửi đến nhà trƣờng, quý thầy, cô giáo viện Cơng nghệ sinh học vàbộ mơn Vi sinh - Hóa sinh lời cảm ơn chân thành tạo cho tơi có hội đƣợc thực đề tài, thể sáng tạo nơi mà tơi u thích, để tơi có hội áp dụng kiến thức mà thầy cô giáo truyền đạt Thơng qua q trình thực để tài, tơi học hỏi đƣợc nhiều điều rút cho nhiều kinh nghiệm q báu để giúp ích cho cơng việc sau thân Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình thực hiện, hồn thiện đề tài khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp từ thầy, cô Sinh viên thực Lê Thị Huệ i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Tổng quan polysacharide 1.1.1 Cấu trúc polysaccharide 1.1.2 Ứng dụng polysaccharide 1.1.3 Các enzyme phân giải polysaccharide 1.1.4 Vi sinh vật phân giải polysaccharide 12 CHƢƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Mục tiêu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Vật liệu 15 2.3.2 Hóa chất 15 2.3.3 Thiết bị, dụng cụ 16 2.3.4 Môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 17 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Phƣơng pháp thu nhận mẫu 17 2.4.2 Phân lập vi khuẩn khiết 18 2.4.3 Tuyển chọn chủng có khả phân giải polysaccharide mạnh 18 2.4.4 Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh hóa chủng tuyển chọn 25 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn có khả phân giải polysaccharide 29 3.2: Tuyển chọn chủng có khả phân giải polysaccharide mạnh 30 ii 3.2.1 Tuyển chọn dựa vào định tính 30 3.2.2 Tuyển chọn dựa vào xác định hàm lƣợng đƣờng khử phƣơng pháp DNS 35 3.2.3.Tuyển chọn chủng có hoạt độ enzyme cellulase, amylase, pectinase 39 3.3 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa hai chủng vi khuẩn TA CM 39 3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 39 3.3.2 Kết nhuộm gram 40 3.4 Xác định đặc tính sinh hóa 41 3.4.1 Khả lên men loại đƣờng 41 3.4.2 Kết phản ứng MR phản ứng VP 43 3.4.3 Phản ứng catalase, khử nitrate, citrate, thử nghiệm tính di động 43 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2.Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Ký hiệu Vi sinh vật VSV Microlit µl Lỗ thạch LT Optical density - mật độ quang OD Môi trƣờng MTCB Môi trƣờng tối ƣu MTTƢ Môi trƣờng nuôi cấy MTNC 35 – dinitrosalicylic DNS Cellobiohydrolase CBH 10 Micromet µm 11 Dalton DA 12 Vịng /phút v/p 13 Mơi trƣờng thích hợp MTTH 14 Cellobiohydrolase CBH 15 Endo glucannase EG 16 Carboxyl methylcellulose CMC 17 B – glucanase BG 18 Phản ứng p/ứ 19 Aspergillus niger A.nige 20 Kilodalton KDa 21 Isoelectrics point Ip 22 Microlit µl iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Một số chất sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.2: Một số thuốc thử sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 16 Bảng 2.4: Danh sách môi trƣờng sử dụng thành phần 17 Bảng 2.5: Trị số OD540 nm đo đƣợc nồng độ đƣờng glucose khác phản ứng với thuốc thử DNS 21 Bảng 2.6: Trị số OD575 nm đo đƣợc nồng độ đƣờng monogalacturonan khác phản ứng với thuốc thử DNS 24 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập 29 Bảng 3.2 Đƣờng kính vịng phân giảicellulose chủng vi khuẩn 31 Bảng 3.3: Đƣờng kính vịng phân giải tinh bột chủng vi khuẩn 32 Bảng 3.4: Đƣờng kính vịng phân giải pectin chủng vi khuẩn 34 Bảng 3.5: Kết quảxác định khả phân giải CMC chủng vi khuẩn 36 Bảng 3.6: Kết xác định khả phân giải tinh bột chủng vi khuẩn 37 Bảng 3.7: Kết xác định khả phân giải pectin chủng VSV 38 Bảng 3.8: Kết tuyển chọn chủng có hoạt độ enzyme cellulase, amylase, pectinase 39 Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái khuẩn lạccủa hai chủng vi khuẩn CM TA 40 Bảng 3.10: Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn 40 Bảng 3.11: Tổng kết đặc tính sinh hóa chủng TA CM 41 Bảng 3.12: Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis 46 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc amylose Hình 1.2: Hạt tinh bột lục lạp amylose Hình 1.3: Cấu trúc amylopectin Hình 1.4: Cấu trúc cellulose Hình 1.5: Cấu trúc pectin Hình 1.6: Sơ đồ hoạt động enzyme them gia thủy phân hồn tồn cellulose Mũi tên vị trí phân cắt enzyme Hình 1.7: Quá trình thủy phân tinh bột enzyme amylase 10 Hình 1.8: Cơ chế tác động pectinase vào phân tử pectin 11 Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn glucose 21 Hình 2.2: Đồ thị đƣờng chuẩn glacturonic 24 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy số chủng phân lập đƣợc 30 Hình3.2: Hình ảnh vịng phân giải CMC chủng C1; C8; TA; H2, CM, L4 31 Hình 3.4: Hình ảnh vịng phân giải pectin chủng có hoạt tính: H2, C8, CM, L4, TA 34 Hình 3.5: Hình ảnh thử enzyme cellulase với thuốc thử DNS 36 Hình 3.6: Hình ảnh thử enzyme amylase với thuốc thử DNS 37 Hình 3.7: Hình ảnh thử enzyme pectinase với thuốc thử DNS 38 Hình 3.8: Khả phân giải loại đƣờng chủng CM 41 Hình 3.9:Khả phân giải loại đƣờng chủng TA 42 Hình 3.10:Kết phản ứng MR phản ứng VP 43 Hình 3.11: Kết phản ứng hoạt hóa catalase 43 Hình 3.12: kết phản ứng khử nitrate 44 Hình 3.13: Kết phản ứng citrate 44 Hình 3.14: Kết thử nghiệm tính di động 45 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Carbohydrate nhóm phân tử sinh học có mặt nhiều trái đất,chiếm khoảng 80-90 % khối lƣợng khô thực vật chất dồi hợp chất hữu tự nhiên, đặc biệt cellulose, tinh bột pectin… Hàng năm thực vật tảo có khả biến - đổi 100 tỷtấn CO2 H2Othành glucose sản phẩm hữu khác nhƣ đƣờng tinh bột thức ăn chủ yếu ngƣời Các hợp chất cacbonhydrate có ý nghĩa lớn đời sống ngƣời, nhiên, với lƣợng sinh khối khổng lồ tạo hàng năm trái đất chƣa thực đƣợc tận dụng cách có hiệu để sản xuất sản phẩm có giá trị cao mà chủ yếu trình phân hủy diễn dƣới tác động hệ enzyme vi sinh vật tồn tự nhiên Vai trò hệ enzyme phân hủy polysaccharide tự nhiên chủ yếu góp phần vào việc khép kín chu trình cacbon trái đất Hệ enzyme phân giải hợp chất là: cellulase, amylase, pectinase từ hệ VSV phong phú đa dạng bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn nấm Trong đó, vi khuẩn có vai trị đáng ý q trình phân giảicác hợp chất bon hệ enzyme từ vi khuẩn thƣờng có hoạt tính mạnh phong phú Để tận dụng khối lƣợng lớn nguồn nguyên liệu từ sinh khối, nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất tối ƣu hóa q trình chuyển hóa hợp chất polysaccharide Một hƣớng chuyển hóa hợp chất hiệu thân thiện với môi trƣờng đƣờng sinh học đƣợc thực hệ enzyme từ vi sinh vật Tuy nhiên, hệ enzyme tham gia vào trình phân giải hợp chất polysaccharide hiệu nhƣ: cellulase, amylase, pectinase đƣợc sử dụng ngành công nghiệp Việt Nam chủ yếu đƣợc nhập từ nƣớc với giá thành cao Ngoài ra, với điều kiện Việt Nam nƣớc nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme phong phú, việc nghiên cứu cải thiện nâng cao hiệu suất trình sản xuất enzyme từ VSV phân lập từ địa địi hỏi cấp thiết Việc tuyển chọn VSV có khả sinh tổng hợp hệ enzyme phân giải polysaccharide, đặc biệt cellulsae, pectinase, amylase giúp tận dụng nguồn gen quý có sẵn từ tự nhiên mà cịn góp phần bảo tồn nguồn gen, cải tạo chủng VSV công nghiệp sử dụng Xuất phát từ thực tế đó, tơi tiến hành đề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme phân giải polysaccharide” với mong muốn tìm đƣợc số chủng vi khuẩn có lực sinh hệ enzyme phân giải polysaccharide cao nhằm nâng cao hiệu trình khai thác sử dụng nguồn nguyên liệu CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Tổng quan polysacharide Cacbonhydrate hợp chất cấu tạo nên hầu hết vật chất hữu tự nhiên Là hợp chất khơng có vai trị quan trọng đời sống, nhƣ: cung cấp dự trữ lƣợng,tạo cấu trúc, bảo vệ… mà cịn đóng góp khơng nhỏ vào ngành cơng nghiệp thực phẩm, công nghiệp đồ uống sản phẩm lên men…[19] Các hợp chất cacbonhydrate đa dạng phong phú, tùy vào cấu tạo đƣợc chia thành loại: polysaccharide (chứa 10 đơn phân tử, nhƣ: amylose, cellulose, pectin, agar, chitin…), oligosaccharide (chứa từ đến 10 đơn phân, nhƣ: saccharose, maltose, rafinose…) monosaccharide (là đơn phân tử, nhƣ: glucose, fructose, galactose, xylose…) Hiện nay, lƣợng cacbonhydrate trái đất ngày lớn sinh khối thực vật phế phụ phẩm ngành nông nghiệp, lâm nghiệp…trong chiếm phần lớn polysaccharide [20] 1.1.1 Cấu trúc polysaccharide Polysaccharide đƣợc tạo thành từ monosaccharide (> 10) liên kết với liên kết glucoside, nhóm – OH glucoside, khơng cịn tính khử.Các monosaccharide polysaccharide thuộc hay nhiều loại khác Trong số trƣờng hợp gốc monosaccharide có chứa nhóm khác nhau: acid sun furic, acid photphoric, acid axetic, Các liên kết gluxit phân tử polysaccharide là: anpha- gluxit hay beta- gluxit [11] Polysacchride gọi glycan, tùy thành phần monose có polysaccharide ngƣời ta chia chúng làm: homopolysaccharide (chỉ chứa loạimonosaccharide) heteropolysaccharide (có loại monosaccharide) Tùy vào kích thƣớc đặc điểm cấu trúc phân tử chúng tạo dung dịch keo tan hồn tồn nƣớc Polysaccharide đóng vai trò quan trọng đời sống động vật, thực vật Ở thực vật, polysaccharide chiếm 80-90% trọng lƣợng khô, tham gia vào thành phần mơ nâng đỡ, ví dụ cellulose, hay tích trữ dƣới dạng thực phẩm dự trữ với lƣợng lớn, ví dụ tinh bột [15] Sự phân bố phổ biến thƣờng gặp polysacchridetrong sống chủ yếu cellulose, tinh bột, pectin 1.1.1.1 Tinh bột Là polysaccharide dự trữ thực vật, quang hợp tạo thành Trong củ hạt có từ 40- 70% tinh bột, thành phần khác xanh có chiếm khoảng từ đến 20% Tinh bột khơng hịa tan nƣớc, đun nóng hạt tinh bột phồng lên nhanh tạo thành dung dịch keo gọi hồ tinh bột Tinh bột có cấu tạo gồm hai phần: amylose amylosepectin, ngồi cịn có khoảng 2% phospho dƣới dạng ester Tỷ lệ amylosepectin/amylose đối tƣợng khác không giống nhau, tỷ lệ gạo nếp lớn gạo tẻ [12] *Amylose Chiếm đến 15-20% lƣợng tinh bột, nhiều gốc α D- glucose liên kết với thông qua C1-C4 tạo thành mạch thẳng không phân nhánh Trong khơng gian cuộn lại thành hình xoắn ốc đƣợc giữ bền vững nhờ liên kết hydro Theo số liệu amylase cịn có chứa α D- glucopyranose dạng thuyền [19] Hình 1.1: Cấu trúc amylose Amylose bắt màu xanh với iodine, màu đun nóng, màu trở lại nguội Một đặc trƣng hóa lý khác cần ý bị kết tủa rƣợu butylic ... VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn có khả phân giải polysaccharide 29 3.2: Tuyển chọn chủng có khả phân giải polysaccharide mạnh 30 ii 3.2.1 Tuyển chọn dựa... tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải polysaccharide khả phân giải polysaccharide chúng Các vi sinh vật phân giải polysaccharide chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ tiêu hóa động... vậy, vi? ??c sử dụng enzyme phân giải polysaccharide có vai trị quan trọng đời sống [8] 1.1.3 Các enzyme phân giải polysaccharide Enzyme thủy phân polysaccharide đƣợc tìm thấy nhiều loại vi sinh