Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ CYA Czapek yeast extract agar HPLC High performance liquid chromatography MEA Malt Extract Agar MNNG N methyl N’nitro N nitrosoguanidine PD[.]
Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ CYA Czapek yeast extract agar HPLC High-performance liquid chromatography MEA Malt Extract Agar MNNG N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth TLC Thin layer chromatography UV Ultra violet Danh mục bảng Bảng 1.1 Sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến 24 Bảng 1.2 Cơ chế tác động tác nhân hóa học gây đột biến 24 Bảng 2.1 Các môi trường nuôi cấy 32 Bảng 2.2 Mơi trường khảo sát đặc điểm hình thái 33 Bảng Thành phần môi trường dinh dưỡng nuôi cấy 37 Bảng 2.4 Thành phần dung dịch môi trường MS 39 Bảng 2.5 Nguồn C, N chất bổ sung lựa chọn 40 Bảng 2.6 Thành phần môi trường nhân giống 41 Bảng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng Penicillium sp LĐL 4.4 môi trường nuôi cấy 44 Bảng Các khuẩn lạc đột biến chọn ngẫu nhiên 49 Bảng Kết định lượng HupA chủng đột biến 51 Bảng Lượng sinh khối tươi thu hàm lượng HupA dịch chiết chủng vi nấm LĐL4.4 môi trường nuôi cấy khác 53 Bảng Ảnh hư ng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL4.4 56 Bảng Ảnh hư ng hàm lượng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL4.4 58 Bảng Ảnh hư ng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL4.4 58 Bảng Ảnh hư ng chất bổ sung tới sinh khối tươi hàm lượng HupA chủng vi nấm nghiên cứu 60 Bảng Ảnh hư ng hàm lượng ethanol tới sinh khối tươi hàm lượng HupA chủng vi nấm LĐL 4.4 nghiên cứu 61 Bảng 10 Khả sinh trư ng chủng nấm LĐL 4.4 số môi trường nhân giống 63 Bảng 11 Ảnh hư ng thời gian nhân giống đến khả sinh tổng hợp HupA chủng vi nấm LĐL 4.4 64 Bảng 12 Ảnh hư ng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp HupA chủng LĐL 4.4 65 Bảng Ảnh hư ng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp HupA chủng LĐL 4.4 66 Bảng 14 Ảnh hư ng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp HupA chủng chủng LĐL 4.4 66 Bảng 15 Ảnh hư ng độ thơng khí đến khả sinh tổng hợp HupA chủng LĐL 4.4 67 Bảng 16 Động thái trình lên men sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL 4.4 thiêt bị lên men lít 69 Danh mục hình ảnh Hình 1.1: Cây Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) [6] Hình 1.2: Cấu trúc hóa học Huperzine A [2] Hình : Nấm nội sinh phát triển rễ Cối xay Phong đường [11] 10 Hình Hình thái khuẩn ty chủng LĐL 4.4 môi trường sau ngày nuôi cấy 46 Hình Đặc điểm vi hình thái chủng Penicillium LĐL 4.4 môi trường sau ngày nuôi cấy 46 Hình Sắc ký đồ (UV 310 nm) Penicillium sp LĐL4.4 hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 47 Hình Tỷ lệ sống sót chủng LĐL 4.4 sau xử lí đột biến 48 Hình Khuẩn lạc chủng đột biến 4.4hc15.2 (A), 4.4hc20.1 (B) 4.4uv30.3 (C) môi trường PDA 50 Hình Sắc kí lớp mỏng – TLC chất thị HupA (a, b), dịch chiết nấm thể 4.4hc20.1 (d), 4.4uv (e) 4.4hc15.2 (f) silica gel Merk 0.25 mm phát thuốc nhuộm KMnO4 0,5% 50 Hình Sắc ký đồ HPLC (UV 10 nm, Ref 90 nm) chất thị Huperzine A (A) mẫu phân tích 4.4hc15.2 (B), 4.4hc20.1 (C) 4.4uv30.3 (D) 51 Hình Sinh khối lên men dịch chiết (hòa Chlorofom) chủng LĐL 4.4 môi trường MT9 54 Hình Sắc kí đồ xác định hàm lượng HupA chủng LĐL 4.4 môi trường MT 55 Hình 10 Sinh khối chủng LĐL 4.4 mơi trường khoai tây (A), Czapek – Dox (B) PDA (C) 63 Hình 11 Sinh khối chủng LĐL4.4 ni cấy pH môi trường khác 66 Hình 3.12 Sinh khối chủng LĐL 4.4 ni cấy nhiệt độ khác 67 Hình 3.13 Sinh khối chủng lắc tốc độ khác 68 Hình 14 Sinh khối lên men chủng LĐL 4.4 quy mô 5L thời gian khác 70 Hình 15 Sắc ký đồ (UV 310 nm) dịch chiết chủng Penicillium sp LĐL4.4 quy mô lên men 5L hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 70 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA VÀ HOẠT CHẤT HUPERZINE A 1.1.1 Cây Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) 1.1.2 Hoạt chất Huperzine A (HupA) 1.2 VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT 1.2.1 Quan hệ vi nấm nội sinh thực vật 10 1.2.2 Một số nghiên cứu phân lập nấm nội sinh loài thực vật khác 11 1.2 Ứng dụng vi nấm nội sinh thực vật 13 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A 14 .1 Các nghiên cứu giới 14 .2 Các nghiên cứu nước 18 1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI NẤM 19 1.4.1 Ảnh hư ng nuôi cấy đến sinh trư ng phát triển vi nấm 19 1.4.2 Các nguồn dinh dưỡng sinh trư ng vi nấm 20 1.5 TẠO GIỐNG VI SINH VẬT BẰNG ĐỘT BIẾN 22 1.5.1 Khái niệm chung 22 1.5.2 Quy trình tạo giống phương pháp gây đột biến 23 1.5 Đột biến chủng tia UV 25 1.5.4 Đột biến chủng MNNG (N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine) 25 1.6 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ [5] 25 1.6.1 Sắc ký mỏng (Thin layer chromatography – TLC) 25 1.6.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography – HPLC ) 27 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 VẬT LIỆU 31 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị thí ngiệm 31 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy bảo quản vi nấm 32 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng nấm 33 2.2 Các phương pháp gây đột biến chủng 35 2.2.4 Các phương pháp nghiên cứu mơi trường ni cấy thích hợp 355 2.2.5 Phương pháp tách chiết hoạt chất Huperzine A từ chủng nấm 42 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt chất HupA 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI HÌNH THÁI CỦA CHỦNG VI NẤM Penicillium sp LĐL 4.4 44 3.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN CHỦNG 47 2.1 Kết sàng lọc chủng đột biến có khả sản sinh Huperzine A 48 2.2 Kết xác định khả sinh tổng hợp HupA chủng đột biến phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao – HPLC 50 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NU I CẤY CHỦNG 52 Kết nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA nghiên cứu mơi trường ni cấy thích hợp 52 Kết nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp 62 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 4.1 KẾT LUẬN 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer (AD) bệnh thần kinh thối hóa tác động đến trí nhớ, suy ngh hành vi người AD ảnh hư ng đến 20 triệu người toàn giới bao gồm 4,5 triệu người Mỹ coi nguyên nhân lớn thứ ba gây tử vong nước phát triển sau bệnh tim mạch ung thư [1] Hiện khơng có phương thức chữa trị cho AD Tuy nhiên, sử dụng chất ức chế cholinesterase (AChEI) hầu hết chiến lược chấp nhận điều trị AD [2] Huperzin A (HupA), Lycopodium alkaloid, tách chiết lần từ thảo dược truyền thống Trung Quốc - Huperzia serrata (Thunb ex Murray) Trev (Thạch tùng cưa) năm 19 [3] Sau cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Trung Quốc cơng bố, nhà khoa học Phương Tây kết luận chất có tác dụng việc chữa trị bệnh suy giảm trí nhớ, đặc biệt bệnh Alzeimer Alkaloid có khả xuyên qua hàng rào mạch máu não tác động trực tiếp lên não với liều lượng thấp tính microgram Trên thực tế, HupA ức chế việc sản sinh acetylcholinesterase, enzym tạo suy thoái acetylcholine Khi mà enzym bị thiếu hụt, có với hàm lượng thấp hàm lượng acetylcholine não tăng lên, giúp cho trí nhớ chức nhận thức cải thiện So với loại thuốc dược phẩm tacrine, donepezil, rivastigmine galanthamine; HupA dẫn xuất bán tổng hợp ZT-1 có hoạt động chống AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học đường uống cao tác dụng độc hại [4, 5] HupA phê duyệt năm 1990 Trung Quốc thuốc điều trị Alzheimer bán thị trường Mỹ chế độ ăn uống bổ sung, ZT-1 hoàn thành giai đoạn II lâm sàng thử nghiệm Trung Quốc châu Âu, năm 2007 nước Pháp coi vấn đề phải quan tâm hàng đầu quốc gia [5] Các nghiên cứu hoạt chất Huperzine A H serrata làm nguyên liệu sản xuất thuốc chữa trị bệnh rối loạn trí nhớ AD thu thành tựu đáng quan tâm Các kế hoạch bảo tồn, phát triển loài số nước có Trung Quốc trọng phát triển Ngoài phát triển trồng trọt, nhân giống invitro quan tâm nhằm nhân nhanh sản lượng tăng cao sản lượng hoạt chất HupA [6, 7] Tuy nhiên, điều kiện nuôi trồng thực vật H serrata nuôi cấy in vitro khó khăn (địi hỏi phải nhiều thời gian kéo dài nhiều năm, chi phí nhiều cho trồng trọt nhân cây) để thu lượng lớn nguyên liệu cho chiết tách lượng lớn HupA phục vụ việc sản xuất thuốc, nên việc tìm kiếm chủng vi nấm sản sinh HupA quan trọng, cần quan tâm hướng nhằm hướng tới nguồn nguyên liệu lớn có hiệu kinh tế cho ngành công nghiệp dược nước điều trị bệnh suy giảm trí nhớ Việt Nam, đáp ứng cho nhu cầu thị trường nước Vi sinh vật nội sinh thường sống mơ thực vật tìm thấy vùng rễ, thân, lá, thực vật Nấm nội sinh thực vật thường sinh trư ng, phát triển nội sinh hồn tồn phần mơ tế bào chủ, thường không gây triệu chứng rõ ràng bệnh Gần đây, nấm nội sinh phân lập từ loại trồng chấp nhận nguồn nguyên liệu quan trọng ngành công nghiệp dược Một lượng lớn hợp chất có cấu trúc hoạt tính sinh học khác chiết xuất từ nấm nội sinh [8] Do đó, việc nghiên cứu phân lập chủng nấm nội sinh H serrata có khả sản sinh hoạt chất HupA nhà khoa học quan tâm nhằm thay thế, tăng cường lượng HupA cho ngành cơng nghiệp dược Đã có nhiều kết nghiên cứu khả quan công bố, đặc biệt Trung Quốc – nơi có H serrata phân bố nhiều Hợp chất Hup A tìm thấy sinh tổng hợp b i loài nấm nội sinh H serrata bao gồm chi chủ yếu Aspergillus, Trichoderma, Alternaria, Podospora, Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis Ở Việt Nam, Thạch tùng cưa phát Sa Pa, Lâm Đồng độ cao 1.000 m Đây loài dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách "đỏ" Chương trình Nghiên cứu bảo tồn phát triển nguồn gen quý thuốc, chưa quan tâm nghiên cứu khai thác ứng dụng điều trị bệnh Việt Nam Mặt khác, Việt Nam trước có nhiều nghiên cứu vi nấm nội sinh số loại trồng, nhiên, nghiên cứu nấm nội sinh Thạch tùng cưa Việt Nam đến chưa có cơng bố Hiện tại, lần Việt Nam, từ năm 2015 đến nay, Viện Công nghệ sinh học có nghiên cứu khn khổ đề tài cấp s cấp Nhà nước chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp HupA Thạch tùng cưa phân bố Việt Nam Nhóm đề tài thu kết khả quan, chủng vi nấm Penicillium sp LĐL4.4 phân lập từ Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt chủng giống có tiềm sinh tổng hợp hoạt chất HupA cao Vì vậy, đề tài: y T ù thực nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp HupA chủng, từ tạo nguồn nguyên liệu chủng giống gốc nghiên cứu, sản xuất hoạt chất HupA phục vụ cho sản xuất thuốc h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ Việt Nam, đặc biệt bệnh Azheimer sau Mụ đí đề : Nâng cao khả sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A chủng nấm Penicillium sp LĐL4.4 nhằm tạo nguồn nguyên liệu chủng giống gốc cho nghiên cứu, sản xuất HupA h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ Việt Nam, đặc biệt bệnh Azheimer d : - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi nấm Penicillium sp LĐL4.4 - Khảo sát khả sinh tổng hợp HupA chủng vi nấm Penicillium sp LĐL4.4 phương pháp đột biến chủng - Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp HupA chủng vi nấm Penicillium sp LĐL4.4 phương pháp nuôi cấy chủng ... hiệu cao – HPLC 50 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO SINH TỔNG HỢP HUPA C? ?A CHỦNG Penicillium sp LĐL4 .4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NU I CẤY CHỦNG 52 Kết nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA nghiên cứu. .. nước chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp HupA Thạch tùng c? ?a phân bố Vi? ??t Nam Nhóm đề tài thu kết khả quan, chủng vi nấm Penicillium sp LĐL4 .4 phân lập từ Thạch tùng c? ?a phân bố Đà Lạt chủng. .. 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI HÌNH THÁI C? ?A CHỦNG VI NẤM Penicillium sp LĐL 4. 4 44 3.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPA C? ?A CHỦNG