THỬ NGHIỆM tác DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO của các CHẾ PHẨM cây TRINH nữ HOÀNG CUNG

ĐẠIHỌC HỌCQUỐC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI TRƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI ĐẠI HỌC HỌC KHOA KHOA HỌC HỌC TỰ TỰ NHIÊN NHIÊN KHOA SƯ PHẠM   KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Phạm Huy Cường Đề tài: THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Lớp: Hµ néi - 2009 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠIHỌC HỌCQUỐC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI TRƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI ĐẠI HỌC HỌC KHOA KHOA HỌC HỌC TỰ TỰ NHIÊN NHIÊN KHOA SƯ PHẠM   Phạm Huy Cường KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG Chuyên ngành Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: nghiệm Mã số : Sinh học thực Lớp: : 60 42 30 Hµ néi - 2009 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VĂN ĐÔ Hà Nội - 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới cán hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Văn Đô - Phó chủ nhiệm môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội người thầy tận tình bảo dẫn dắt nghiên cứu khoa học, giải nhiều khó khăn, vướng mắc trình thực luận văn, đóng góp ý kiến quý báu tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng quý trọng biết ơn sâu sắc tới GS TSKH Phan Thị Phi Phi người thầy tận tình bảo đóng góp ý kiến quý báu tạo điều kiện tốt cho trình học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm – Giám đốc Công ty TNHH Thiên Dược, tỉnh Bình Dương tạo điều kiện thuận lợi tình cảm kinh phí để hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Phạm Đăng Khoa – Chủ nhiệm môn, PGS TS Nguyễn Thanh Thúy – Phó chủ nhiệm môn, toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ, nhân viên khoa Xạ Bệnh viện K Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Nhân dịp này, cho gửi lời cám ơn tới thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Các thầy cô cho kiến thức mẻ cần thiết để thấy thêm tự tin, bước tiếp đường nghiên cứu khoa học Và hết, muốn gửi tới lời cảm ơn chân thành đến người thân gia đình bạn bè bên động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập làm việc Chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 12 tháng 12 năm 2012 Học viên Phạm Huy Cường NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribonucleic AIDS : Acquired Immunodeficiency Syndrome ARN : Acid Ribonucleic B2M : Beta microglobulin CD : Cluster of Differenciation cDNA : Complementary Deoxyribonucleic DDT : D-dopacchrome tautomerase dNTP : Deoxyribonucleotid Triphotphat EBV : Epstein Barr Virus ELISA : Enzyme – Linker Immunosorbent Assay HIV : Human Immunodeficiency Virus HLA : Human Leucocyte Antigen HPLC : High Perfomance Liquid chromatography IL-2 : Interleukin – IL-2R : Interleukin – Receptor KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể LGL : Larger gramilar lymphocyte MHC : Major Histocompatibility Complex NK : Natural Killer PCR : Polymerase Chain Reaction SCF : Stem cell factor SGMD : Suy giảm miễn dịch TNFα : Tumor Necrosis Factor alpha TNHC : Trinh nữ hoàng cung UTCTC : Ung thư cổ tử cung UTDD : Ung thư dày UTVMH : Ung thư vòm mũi họng MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Trinh nữ hoàng cung 1.1.1 Phân biệt TNHC với náng khác 1.1.2 Thành phần hóa học Crinum latifolium L 1.1.3 Tình hình nghiên cứu TNHC Việt Nam .7 1.2 Vai trò hệ thống đáp ứng miễn dịch ung thư .8 1.2.1 Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư 1.2.2 Suy giảm miễn dịch 1.2.3 Ung thư vòm mũi họng 11 1.2.4 Nguyên nhân ung thư vòm 11 1.3 Tình hình nghiên cứu thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 13 1.3.1 Vai trò cytokin 14 1.3.2 Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thư .17 1.3.3 Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 24 1.3.4 Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư TNHC 25 Chương 28 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 2.2 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2.1 Bệnh nhân .28 2.2.2 Người bình thường .29 2.2.3 Vật liệu nghiên cứu 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Nuôi cấy tế bào lympho 30 2.3.2 Đếm số lượng bạch cầu dòng bạch cầu lympho 31 2.3.3 Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy .31 2.3.4 Tổng hợp cADN 32 2.3.5 Kỹ thuật RT-PCR 33 2.3.6 Sơ đồ nghiên cứu 39 2.3.7 Kỹ thuật ELISA định lượng IL-2 TNFα dịch nuôi cấy tế bào lympho 39 Chương 41 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1 Kiểm tra chất lượng ARN chiết tách 41 3.2 Phản ứng RT-PCR đơn mồi gen B2M, IL-2 TNFα .42 3.3 Phản ứng RT-PCR đa mồi gen B2M với IL-2/TNFα .44 3.4 Sự biểu lộ IL-2 mức độ mARN lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với thuốc thử 45 3.5 Sự biểu lộ mARN TNFα lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử 48 3.6 So sánh biểu lộ protein gen IL-2 dịch nuôi cấy lympho bào xác định ELISA 50 3.7 So sánh biểu lộ protein gen TNFα dịch nuôi cấy có sử dụng thuốc thử 56 (A) (B) 58 Sự biểu lộ TNFα mức độ mARN khác biệt nhóm chứng âm dương Sự biểu lộ thấp so với kích thích Crilin T hai nồng độ 0,25mg 0,5mg Ở mức độ protein cho kết tương tự (Hình 3.18A hình 3.18B) Như vậy, kỹ thuật ELISA RT-PCR cho kết tốt biểu lộ TNFα .58 3.8 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch Crilin T so với nhóm chứng dương Levamisol .58 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 61 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh TNHC Lan huệ .4 Bảng 1.2 Các hỗn hợp alkaloid TNHC [39] 6 Bảng 2.1 Thành phần dung dịch PBS .30 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR đơn mồi 34 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR đa mồi 36 Bảng 2.4 Tương quan nộng độ gel agarose kích thước đoạn ADN cần phân tách 37 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) Hình 1.2 Những khác họ với Crinum Hình 1.3 Cấu trúc hóa học số Alkaloid [39] .5 Hình 3.1 RT-PCR đơn mồi xác định biểu lộ gen B2M, IL-2 TNFα tế bào dòng chuẩn 43 Hình 3.2 Hình ảnh PCR đa mồi cặp gen nội chuẩn (A) Các băng khuếch đại mARN gen B2M IL-2; (B) B2M TNFα Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) .45 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR IL-2 lympho người bình thường nuôi cấy Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) 46 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR IL-2 lympho nuôi cấy bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) 47 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR TNFα lympho người bình thường nuôi cấy Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) 49 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR TNFα lympho bệnh nhân ung thư vòm mũi họng nuôi cấy Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) 49 Hình 3.7 So sánh biểu lộ IL-2 Levamisol với chứng âm bệnh nhân (p=0,045) 51 Hình 3.8 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương 0,25mg Crilin T tế bào bệnh nhân in vitro (p= 0,14) 52 Hình 3.9 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương 0,5mg Crilin T dịch nuôi cấy in vitro tế bào lympho từ bệnh nhân (p=0,39) 52 Hình 3.10 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào lympho in vitro (p=0,23) 52 Hình 3.11 So sánh biểu lộ Il-2 lympho kích thích Levamisol với chứng âm người thường (p=0,18) 54 Hình 3.12 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương 0,25mg Crilin T dịch nuôi cấy người thường in vitro (p=0,42) 54 Hình 3.13 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương 0,5mg Crilin T dịch nuôi cấy người thường in vitro (p=0,30) 55 Hình 3.14 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào người bình thường in vitro (p = 0,34) 55 Hình 3.15 So sánh nồng độ IL-2 tế bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng người bình thường in vitro .56 Hình 3.16 So sánh nồng độ TNFα liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào lympho in vitro (p=0,17) .57 Hình 3.17 So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào người bình thường in vitro (p=0,42) 57 Hình 3.18 So sánh biểu lộ TNFα hai mức độ mARN Protein tế bào lympho người bình thường .58 Hình 3.18 So sánh biểu lộ TNFα hai mức độ mARN Protein tế bào lympho người bình thường .58 MỞ ĐẦU Trinh nữ hoàng cung (THNC) loại thuốc sử dụng thuốc cổ truyền nhiều nước nhiệt đới cận nhiệt đới toàn giới [12] Hiện nay, người ta phát đến 130 loài khác nhau, phân bố nước nhiệt đới 150 alkaloid loài chiết tách [17], [18] TNHC (Crinium latifolium (L.) dùng loại thuốc y học cổ truyền để điều trị bệnh Viêm khớp dạng thấp, ung thư, lao, viêm vi khuẩn sinh mủ…Ở Trung quốc Việt nam, thuốc sắc nước nóng loài dùng để điều trị nhờ hoạt tính chống virut chống ung thư, đặc biệt ung thư tuyến tiền liệt ngày [41] Một số nghiên cứu chiết xuất từ TNHC, xác với tên Trinh nữ Crila [16] thử nghiệm in vitro in vivo [8], [39], [40] Trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi nuôi cấy chuột thực nghiệm cho thấy chất chiết hoạt hóa tế bào lympho T nuôi cấy chuột Balb/c Nhiều hoạt chất có tác dụng chống phân bào, ức chế phát triển tế bào ung thư đồng thời phục hồi chức miễn dịch Viên nang Crila biệt dược Nguyễn Thị Ngọc Trâm, chiết từ Trinh nữ Crila sản xuất từ alkaloid có hoạt tính sinh học Thuốc đăng ký sản xuất, sử dụng rộng rãi Việt Nam số nước để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt u xơ tử cung Ngoài ra, viên Crila nghiên cứu sử dụng để điều trị thực nghiệm tế bào dòng ung thư vú, tử cung, dày, phổi, tuyến tiền liệt số bệnh nhân ung thư tự nguyện [17], [30] Các phân đoạn chứng minh có tác dụng tăng cường miễn dịch chống ung thư mạnh (gồm alkaloid flavonoid) chiết làm thành viên nén có tên Crilin T Các đặc tính hóa, lý tác dụng độc tính cấp, bán cấp…của thuốc đánh giá Chúng tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro mô hình bệnh nhân ung thư có suy giảm miễn dịch, cách nuôi cấy tế bào máu ngoại vi bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn thử nồng độ thuốc khác theo dõi đáp ứng miễn dịch chống ung thư dấu ấn biểu lộ IL-2, TNFα mức độ ARN protein phương pháp RT-PCR ELISA cách tương ứng Đề tài nhằm mục đích: Xác định biểu lộ IL-2 TNF-α mức độ mARN protein tế bào lympho nuôi cấy in vitro bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn người bình thường lâm sàng với hai liều thuốc khác Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch Crilin T so với Levamisol Khi so sánh biểu lộ IL-2 lympho bào bệnh nhân với nồng độ Crilin T với levamisol, cho thấy 6/9 mẫu liều thấp 7/9 (77.7%) mẫu liều cao có biểu lộ cao so với Levamisol (Hình 3.8 hình 3.9) Với tỷ lệ này, chứng tỏ Crilin T có tác dụng kích thích miễn dịch cao Levamisol Khi xem xét liều thuốc Crilin T khác nhau, liều thấp cho đáp ứng so với liều cao (Hình 3.10) Tuy nhiên, khác biệt ý nghĩa thống kê, cỡ mẫu thấp Các kết phù hợp với biểu lộ mARN phát RT-PCR Vì đối tượng nghiên cứu máu bệnh nhân ung thư vòm họng giai đoạn muộn hay người bình thường khác di truyền học, khả đáp ứng tế bào lympho nuôi cấy với tác nhân sinh học khác nhau, cho kết khác Tuy tỷ lệ đáp ứng số mẫu nghiên cứu cao kích thích Crilin T Đối với đối tượng người thường, thu kết sau: Nhóm chứng có biểu lộ tốt, Levamisol cao chứng âm (Hình 3.11), liều thấp cao kích thích cao Levamisol (4/5) (Hình 3.12 hình 3.13) liều cao lại cho biểu lộ cao liều thấp (Hình 3.14) Tuy nhiên, khác biệt ý nghĩa thống kê 53 Hình 3.11 So sánh biểu lộ Il-2 lympho kích thích Levamisol với chứng âm người thường (p=0,18) Hình 3.12 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương 0,25mg Crilin T dịch nuôi cấy người thường in vitro (p=0,42) 54 Hình 3.13 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương 0,5mg Crilin T dịch nuôi cấy người thường in vitro (p=0,30) Hình 3.14 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào người bình thường in vitro (p = 0,34) Để xem xét tổng hợp biểu lộ IL2 nhóm người thường nhóm người bệnh, thấy biểu lộ nhóm người bệnh tốt nhóm người thường (Hình 3.15) Điều phù hợp với sinh học đáp ứng miễn dịch bình thường tốt kích thích miễn dịch, khả tăng đáp ứng thấp tình trạng hệ miễn dịch suy yếu kích thích có đáp ứng tốt bệnh nhân ung thư Nhận xét chứng minh nhiều tác giả khác trước dùng chất kích thích miễn dịch khác [4], [5] 55 Hình 3.15 So sánh nồng độ IL-2 tế bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng người bình thường in vitro 3.7 So sánh biểu lộ protein gen TNFα dịch nuôi cấy có sử dụng thuốc thử Khác với IL-2, TNFα biểu lộ cao tế bào nuôi cấy in vitro, dù có 4h sau nuôi cấy Và thuốc Crilin T có tác dụng cao nhóm chứng nhiều Trong hai liều sử dụng liều cao thấy tốt (Hình 3.16 hình 3.17) Khi so sánh bệnh nhân người thường cho thấy bệnh nhân đáp ứng tốt Sự biểu lộ cao TNFα có nhiều tế bào tiết ra, không giống IL-2 có tế bào lympho T hoạt hóa kháng nguyên 56 Hình 3.16 So sánh nồng độ TNFα liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào lympho in vitro (p=0,17) Hình 3.17 So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg 0,5mg tế bào người bình thường in vitro (p=0,42) 57 (A) (B) Hình 3.18 So sánh biểu lộ TNFα hai mức độ mARN Protein tế bào lympho người bình thường Sự biểu lộ TNFα mức độ mARN khác biệt nhóm chứng âm dương Sự biểu lộ thấp so với kích thích Crilin T hai nồng độ 0,25mg 0,5mg Ở mức độ protein cho kết tương tự (Hình 3.18A hình 3.18B) Như vậy, kỹ thuật ELISA RT-PCR cho kết tốt biểu lộ TNFα 3.8 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch Crilin T so với nhóm chứng dương Levamisol IL-2 TNFα hai cytokin nghiên cứu nhiều với mục đích liệu pháp điều trị miễn dịch IL-2 có chức kích thích phân chia tế bào lympho T gây độc, lympho T giúp đỡ, tế bào diệt tự nhiên đại thực bào Tất chức tham gia vào chế chống ung thư hệ miễn dịch TNFα, 58 peptid, có vai trò quan trọng chế bảo vệ thể Nó làm tăng chức tế bào mônô đại thực bào để gây độc cho tế bào ung thư, gây biểu lộ nhiều chất trung gian chống viêm điều hòa miễn dịch Theo Gan cs 2003 việc tiết TNFα sớm không kéo dài tiết IL-2 dùng chất kích thích miễn dịch từ thực vật [23] Kết tương tự vài mẫu số thời điểm nghiên cứu Tuy nhiên, số mẫu thấp, thời điểm nên việc theo dõi động học công trình chưa thể có kết luận thống kê Qua kết thu hai biểu lộ IL-2 TNFα thực nghiệm trên, ta thấy Crilin T có tác dụng mạnh Levamisol, đặc biệt TNFα có chế tiết cao sớm nhiều so với Levamisol Kết phù hợp với tác giả nghiên cứu chế phẩm Crila nước quốc tế tác dụng tăng cường miễn dịch [19], [26], [40] Levamisol chất tổng hợp nên có nhiều tác dụng phụ nặng biết rõ sử dụng lâm sàng, đó, Chế phẩm Crilin T chiết từ dược thảo có nhiều tác dụng tăng cường miễn dịch Có thể hỗ trợ cho điều trị số bệnh ung thư Việc nghiên cứu cách có hệ thống với số mẫu lơn giúp đánh giá toàn diện tìm hiểu chế tác dụng thuốc vào tế bào đích ung thư cần thiết 59 KẾT LUẬN Từ kết mô hình thực nghiệm nuôi cấy tế bào suy giảm miễn dịch bệnh nhân UTVMH giai đoạn muộn người bình thường lâm sàng rút kết luận sau: - Sự biểu lộ IL-2 mẫu nuôi cấy tế bào lympho có mặt Crilin T nhóm người ung thư vòm họng cao nhóm người bình thường, liều thấp Crilin T cho kết tốt - TNFα mẫu nuôi cấy tế bào lympho nhóm người ung thư vòm họng cao nhóm người bình thường, liều cao Crilin T cho kết tốt Đáp ứng TNFα xảy sớm, sau 4h nuôi cấy tế bào lympho in vitro với Crilin T - Crilin T có xu hướng đáp ứng tốt so với Levamisol hai cytokin IL-2 TNFα 60 KIẾN NGHỊ - Cần phải tăng số mẫu nghiên cứu để đánh giá xác - Thử tác dụng thuốc liều lượng khác - Xây dựng mô hình thực nghiệm ung thư hóa chất để thử tác dụng miễn dịch in vivo 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Vũ Triệu An, Jean Claude Homberg, (1997), Miễn dịch học NXB Y học, 1997 Trần Ngọc Anh, Phan Thu Giang, Trần Văn Quy (2006), Nghiên cứu định tính, định lượng crinamidin dược liệu viên nang trinh nữ hoàng cung phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Kiểm nghiệm thuốc, 4(14), tr 10-14 Phạm Hoàng Anh, Nguyễn Hoài Nga, Trần Hồng Trường cs (2000), “Tình hình bệnh ung thư Hà nội giai đoạn 1996-1999” Tạp chí Y học thực hành chuyên đề ung thư học, Số 431, tr 4-7 Đỗ Hòa Bình (2003), Một số thay đổi số lượng chức tế bào lympho tần suất biểu lộ Protein LMP1, P53, MDM2 bệnh nhân ung thư vòm họng Luận án Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội Đỗ Hòa Bình, Phan Thị Phi Phi, Phan Thu Anh cs (1993), “Nghiên cứu tình trạng suy giảm đáp ứng miễn dịch tế bào bệnh nhân ung thư vòm họng trước điều trị”, Tạp chí Y học Việt Nam, số 9, tr 1-5 Đỗ Hòa Bình, Phan Thị Phi Phi, Bạch Khánh Hòa cs (2001), “Sự thay đổi nồng độ IL2 IL-10 nước nuôi cấy lympho bào máu ngoại vi bệnh nhân UTVH” Tuyển tập công trình NCKH NCS,Tập 5, tr 2-5 Trần Ngọc Dung (2000), Nghiên cứu thông số miễn dịch - sinh học giúp tiên lượng, phát sớm tái phát UTVH kết hợp viên M sau xạ trị nhằm giảm tái phát, Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội Nguyễn Nam Hải, Nguyễn Tiến Vững (2006), “Phân lập xác định cấu trúc hai flavonoid từ Crium latifolium L”, Tạp chí Dược học, Số 1, tr 7-8 62 Võ Thị Bách Huệ, N.K.Q.C., Ngô Văn Thu, Delome Frederic, Daniel F Michel Becchi (1999), “Khảo sát alcaloid chiết từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) kỹ thuật sắc ký ghép với khối phổ (GC - MS)”, Tạp chí Dược học 10 Nguyễn Ngọc Lanh, Văn Đình Hoa cs (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất y học 11 Nguyễn Ngọc Lanh, Vũ Triệu An, Phan Thị Phi Phi, Văn Đình Hoa, Phan Thị Thu Anh, Trần Thị Chính, Dương Ngọc Quý (2003), Miễn dịch học Xuất lần II Nhà xuất Y học 12 Đỗ Tất Lợi (2003), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học Hà Nội, tr 511-512 13 Phan Thị Phi Phi (1997), “Đại cương Cytokin”, Giáo trình giảng dạy sau đại học 14 Nguyễn Nhật Thành, Phạm Thị Ninh, Trần Thị Phương Thảo, Hoàng Minh Châu, Trần Văn Sung (2011), “Nghiên cứu thành phần hóa học trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) trồng Đồng Nai, Việt Nam”, Tạp chí Hóa Học, Số 49 (6A), tr.355-361 15 Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2009), Nghiên cứu khả kích thích hệ miễn dịch chống ung thư alkaloid va Flavonoid chiết xuất từ trinh nữ hoàng cung (crinum latifonium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc bổ trợ điều trị ung thư Báo cáo tổng hợp kết khoa học công nghệ nhiệm vụ hợp tác quốc tế khoa học công nghệ theo nghị định thư Việt nam Bungari, Bộ khoa học công nghệ 16 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Trần Công Khánh (2012), “Trinh nữ CRILACrinum latifolium L var crilae Tram & Khanh, var n.: Một thứ loài Trinh nữ Hoàng cung-Crinum latofolium L (Họ náng -Amaryllidaceae) Việt nam”, Tạp chí Sinh học, 34(2), tr 190-193 63 17 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Z.K., V Bankova, S Popov, E Zvetkova, E Katzarovo, Lê Văn Hương (2001), “Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn alkaloid từ trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.,Amaryllidaceae)” Tạp chí Dược học, số 11, tr 21-23 18 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Bảo Lộc (2001), “Khảo sát thực vật, nuôi trồng thu hái trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L)” Tạp chí Dược học, Số 2, tr 21-22 19 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Phan Thị Phi Phi., Phan Thị Thu Anh cs (2008), “Tác dụng phục hồi tổn thương tế bào lympho T dòng tủy viên nang Crila Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí Dược học, Số 5, tr 12-14 20 Cao Hữu Vinh (2009), Nghiên cứu nồng độ TNFα bệnh nhân nhồi máu não giai đoạn cấp, Luận văn Y học, tr 40-60 Tiếng Anh 21 Chuchawankul, S., N Khorana, and Y Poovorawan (2012), “Piperine inhibits cytokine production by human peripheral blood mononuclear cells” Genet Mol Res, 11(1), pp 617-27 22 Dong, H., et al (2010), “Selective effects of Lactobacillus casei Shirota on T cell activation, natural killer cell activity and cytokine production”, Clin Exp Immunol, 161(2), pp 378-88 23 Gan, L., et al (2003), “A polysaccharide-protein complex from Lycium barbarum upregulates cytokine expression in human peripheral blood mononuclear cells” Eur J Pharmacol, 471(3), pp 217-22 24 Geng, X., et al.(2012), “Interleukin-2 and autoimmune disease occurrence and therapy”, Eur Rev Med Pharmacol Sci, 16(11), pp 1462-7 25 Ghosal Sh., S.K.S.a.F.A.W (1983), “Alkaloids of Crinum latifolium” Phytochemistry, 22, pp 2305-2309 64 26 Ghosal Sh., S.K.S.a.R.S (1985), “Crinum alkaloids: their chemistry and biology.” Phytochemistry, 24, pp 2141-2156 27 Ghosal Sh., S.K.S.a.A.V.K (1984), “1,2-beta-Epoxyambelline, an immunostimulant alkaloid from Crinum latifolium”, J Chem Research (S), pp 232-233 28 Henegariu, O., et al (1997), “Multiplex PCR: critical parameters and stepby-step protocol”, Biotechniques,23(3), pp 504-11 29 Hu, L.F., et al (1991), Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF-1 gene (LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma J Gen Virol, 72 ( Pt 10), pp 399-409 30 Jenny, M., et al (2011), “Crinum latifolium leave extracts suppress immune activation cascades in peripheral blood mononuclear cells and proliferation of prostate tumor cells”, Sci Pharm, 79(2), pp 323-35 31 Kobayashi Sh., T.T., Kihara M., Imakura Y.,Shingu T and Taira Z (1984), “Alkaloidal constituents of Crinum latifolium and Crinum bulbispermum (Amaryllidaceae)”, Chem Pharm Bul, 32, pp 3015-3022 32 Kobayashi Sh., T.T.a.T.Z.(1984), “Lati-fine, a biogenetic isomer of cherylline, from Crinum latifolium L.”, J Chem Soc.Chem Commun, pp 1043-1044 33 Lai K.N., H.S., et al (1991), “Soluble interleukin-2 receptors in patiens with nasopharyngeal carcunima” Cancer, 67, pp 2180-2185 34 Liu, Y., et al (2009), “Immunostimulatory properties and enhanced TNFalpha mediated cellular immunity for tumor therapy by C60(OH)20 nanoparticles” Nanotechnology, 20(41), pp 415-419 35 Li, W., H Li, and F Gu (2012), “CRP and TNF-alpha induce PAPP-A expression in human peripheral blood mononuclear cells”, Mediators Inflamm, 32, pp 697-702 65 36 Marchetti, G., et al (2004), “Interleukin-2 immunotherapy exerts a differential effect on CD4 and CD8 T cell dynamics”, AIDS, 18(2), pp 211-217 37 Markoulatos, P., N Siafakas, and M Moncany (2002), “Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach”, J Clin Lab Anal, 16(1), pp 47-51 38 Moran-Utrera, Y., et al.(2012), “Trypanosoma cruzi SSP4 Amastigote Protein Induces Expression of Immunoregulatory and Immunosuppressive Molecules in Peripheral Blood Mononuclear Cells”, J Trop Med, 6(2), pp 829-939 39 Nguyen Thi Ngoc Tram, et al (2002), GC-MS of Crinum latifolium L Alkaloids, Z Naturforsch C, 57(3-4), pp 239-242 40 Nguyen Thi Ngoc Tram, E.Z., E Nikolova, E Katzarova, G Kostov, I Yanchev, O Baicheva (1999), “A novel in vitro and invio T-lymphocyte activating factor in Crinum latifolium L aqueous extracts”, Experimental Pathology and Parasitology, 3, pp 21-26 41 Nguyen Thi Ngoc Tram, Z.G.K., Nedyalka V Handjieva, Vassya S Bankova and Simeon S Popov (2003), “Volatiles from Crinum latifolium”, J Essent Oil Res, 15, pp 195-197 42 Nguyen-Van, D., et al (2011), “Epstein-Barr virus-positive diffuse large Bcell lymphoma of the elderly expresses EBNA3A with conserved CD8 T-cell epitopes”, Am J Blood Res, 1(2), pp 146-59 43 Mutch – RS, Hutson – PR (1991), “Levamisol in the adjiuvant treatmen of colon cancer”, Clin - Pharm, 10, pp 95-109 44 Roux, K.H (2009), “Optimization and troubleshooting in PC”, Cold Spring Harb Protoc, 2009(4), pp 66 66 45 S Davila-Velazque-JR; Santos - Preciado - JI; Martinez - Cairo – S (1998), “Effect of levamisol on microbicidal activity and chemotaaxis in polymorphonuclear cells”, Rev - Alerg - Mex, 45(2), pp 43-80 46 Theze, J., P.M Alzari, and J Bertoglio (1996), “Interleukin and its receptors: recent advances and new immunological functions”, Immunol Today, 17(10), pp 481-487 47 Vivitskii – VM, Kyia - ES; Dziubak – ST (1991), “Immunomodullating of levamisol in antibiotic therapy”, Antibiot - Khimioter, 21, pp 25-28 48 Wang, S., et al.(2011), “Subcellular resolution mapping of endogenous cytokine secretion by nano-plasmonic-resonator sensor array” Nano Lett, 11(8), pp 3431-3435 49 Zajac, P., A Schutz, D Oertli Ch Noppen, C Scheafer, M Hebere, G Spagnoli, W.R Marti (1991), “Enhancerd generation of cytotoxic T lymphocytes using recombinant vaccinia virus expressing human tumor assocciated antigents ang B7 costimulatory moleccules” Cancers, 58(20), pp 4567-4571 50 Zhang, X., et al.(2009), "Analysis of Amaryllidaceae alkaloids from Crinum by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry", Rapid Commun Mass Spectrom, 23(18), p 2903-2919 51 Zvetkova, E., et al.(2001), “Aqueous extracts of Crinum latifolium (L.) and Camellia sinensis show immunomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear cells”, Int Immunopharmacol, 1(12), pp 2143-50 67 [...]... các cơ chế như quá trình điều hòa bằng kháng nguyên, các globulin miễn dịch, thụ thể bề mặt tế bào lympho T (TCR), các tế bào lympho T hỗ trợ (Th), tế bào lympho T ức chế (Ts),… Các cytokine có tác dụng tăng cường hoặc ức chế đáp ứng miễn dịch Tác dụng của các cytokin thường không đặc hiệu Các cytokin có tác dụng kích thích thường thông qua việc thành lập các vòng khếch đại để làm tăng số lượng các lympho... năng Các cytokin đều là các chất trung gian hòa tan, có tác dụng khởi động đáp ứng miễn dịch và phản ứng viêm Chức năng sinh học chung của các cytokin là trung gian trao đổi thông tin giữa các tế bào Các cytokin có hoạt tính rất mạnh, ở nồng độ femtomolar (10-15M) nó đã có tác dụng sinh học Một trong những tác dụng quan trong của cytokin là điều hòa miễn dịch Hệ miễn dịch được điều hòa bằng một loạt các. .. Lycorine, (-) Lycorine-1-0-β-glucoside, Pratorimine, Pratorinine, Pratosine, Pseudolycorine1-0-β-D-glucpside [25], [27] + Crinum latifolium L Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayne, (-) Acetyllycorine, Cherylline (S), (+) Crinamine, (-) Crinine (Vittatine, Crinidine), Hamayne (Bulbispermine, Demethylcrinamine), Hipeastrine, Latifine (S), Undulatine [31] Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số Alkaloid [39] 5 Powelline,... hóa học của cây náng có tên khoa học Crinum latifolium L [25], [26], [32], [39], [51] • Thành phần alkaloid của cây Crinum latifolium L + Crinum latifolium L Ấn Độ: 11-O-Acetylambelline, 11-O-Acetyl-1,2-βepoxyambelline, Ambeline, Crinafolidine, Crinafoline, (-) 2-Epilycorine, 2Epipancrassidine, 1,2-β-epoxyambelline, Hippadine (Pratorine, Alkalois N3), Latindine, Latisodine, Latisoline (Latisodine-O-β-D-glucopyranosyl),... làm tăng cường: IL-2, IFNγ, IL-15 và nhóm ức chế miễn dịch: IL-10 Đối với miễn dịch dịch thể cytokin làm tăng cường là (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 còn nhóm ức chế là IFNγ, IL-12 Ngoài tác dụng tăng cường hay ức chế miễn dịch, có cytokin còn tham gia vào quá trình tạo máu gồm tăng cường: yếu tố tế bào gốc (SCF = stem cell factor), IL-3, IL-11, GM-CSF, GCSF, M-CSF, erythroprotein và nhóm ức chế. .. Powelline, + Cây TNHC Việt Nam với tên mới là Trinh nữ Crila (Crinum latifolium L.): 9Octadecenamideb, Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine, Crinane-3-α-ol, Buphannidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6hydroxybuphannidrine, 1β,2β-epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine, Epoxy-3,7dimethoxycrinane-11-one, Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7dihydroxy-3-vinyloxyflavan,... tố sao mã đối với protein điều hòa và các enzyme cũng như tăng cường tổng hợp một số protein và cytokin 23 Tác dụng sinh học sau đó của TNFα tùy thuộc và từng loại tế bào đích và sự phối hợp với các cytokin khác như là IL-1 và IL-6 Các cytokin kích thích sản xuất các protein trong đoạn cấp và sau đó tăng cường hiện tượng thực bào, kìm hãm hoạt động của các enzyme phân hủy protein và một vài quá trình... lên sự tăng sản xuất và tăng hoạt hóa của các hệ thống tế bào này Đa số các cytokin hiện được dùng như các dấu ấn cho biết tình trạng hoạt hóa miễn dịch hơn là sự suy giảm miễn dịch Các mức tăng cao của cytokin có liên quan đến mức độ hoạt động của bệnh Vì vậy, xét nghiệm các dấu ấn này có giá trị trong đánh giá mức độ nặng của bệnh, theo dõi diễn biến là tiên lượng bệnh cũng như đánh giá kết quả của. .. đo lường các sản phẩm của tế bào miễn dịch có thể cho ta những thông tin về trạng thái miễn dịch mà các phương pháp hình thái học khác 16 (xét nghiệm tế bào lympho máu ngoại biên, sinh thiết một tổ chức, cơ quan…) không có khả năng cung cấp Phần lớn các loại phân tử được xét nghiệm hiện nay là sản phẩm tận của một chuỗi các quá trình hoạt động tế bào Mức tăng cao trong huyết thanh hay trong dịch nuôi... một lymphokin hoặc interleukin, được đánh số lần lượt theo thứ tự phát hiện ra chúng: Interleukin 1, 2, 3, 4, 5, 6… Các interleukin này có những ảnh hưởng trên các tế bào của hệ thống miễn dịch và ngay cả trên các tế bào khác Thí dụ các tế bào hệ thống thần kinh Các cytokin, sau khi được giải phóng sẽ gắn lên các thụ thể bề mặt tế bào, làm biến đổi quá trình sao chép gen (ARN) và quá trình dịch mã gen