THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (LUẬN ÁN THẠC SĨ)THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (LUẬN ÁN THẠC SĨ)THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (LUẬN ÁN THẠC SĨ)THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (LUẬN ÁN THẠC SĨ)THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (LUẬN ÁN THẠC SĨ)THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (LUẬN ÁN THẠC SĨ)
MỤC LỤC MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Trinh nữ hoàng cung 1.1.1 Phân biệt TNHC với náng khác .5 1.1.2 Thành phần hóa học Crinum latifolium L .7 1.1.3 Tình hình nghiên cứu TNHC Việt Nam .9 1.2 Vai trò hệ thống đáp ứng miễn dịch ung thƣ 10 1.2.1 Đại cƣơng đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ 10 1.2.2 Suy giảm miễn dịch 10 1.2.3 Ung thƣ vòm mũi họng 13 1.2.4 Nguyên nhân ung thƣ vòm 13 1.3 Tình hình nghiên cứu thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 15 1.3.1 Vai trò cytokin 16 1.3.2 Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ 19 1.3.3 Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 26 1.3.4 Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thƣ TNHC 27 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 30 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 30 2.2.1 Bệnh nhân 30 2.2.2 Ngƣời bình thƣờng 31 2.2.3 Vật liệu nghiên cứu 31 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Nuôi cấy tế bào lympho 32 2.3.2 Đếm số lƣợng bạch cầu dòng bạch cầu lympho 33 2.3.3 Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy 33 2.3.4 Tổng hợp cADN 35 2.3.5 Kỹ thuật RT-PCR 35 2.3.6 Sơ đồ nghiên cứu .41 2.3.7 Kỹ thuật ELISA định lƣợng IL-2 TNFα dịch nuôi cấy tế bào lympho 41 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 3.1 Kiểm tra chất lƣợng ARN chiết tách đƣợc 43 3.2 Phản ứng RT-PCR đơn mồi gen B2M, IL-2 TNFα 44 3.3 Phản ứng RT-PCR đa mồi gen B2M với IL-2/TNFα 46 3.4 Sự biểu lộ IL-2 mức độ mARN lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với thuốc thử 47 3.5 Sự biểu lộ mARN TNFα lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử 50 3.6 So sánh biểu lộ protein gen IL-2 dịch nuôi cấy lympho bào đƣợc xác định ELISA 53 3.7 So sánh biểu lộ protein gen TNFα dịch nuôi cấy với thuốc thử 58 3.8 Đánh giá tác dụng tăng cƣờng miễn dịch Crilin T so với nhóm chứng dƣơng Levamisol 60 KẾT LUẬN .60 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM THAM KHẢO 62 MỞ ĐẦU Trinh nữ hoàng cung (THNC) loại thuốc đƣợc sử dụng thuốc cổ truyền nhiều nƣớc nhiệt đới cận nhiệt đới toàn giới [12] Hiện nay, ngƣời ta phát đến 130 loài khác nhau, phân bố nƣớc nhiệt đới 150 alkaloid loài đƣợc chiết tách [17], [18] TNHC (Crinium latifolium (L.) đƣợc dùng nhƣ loại thuốc y học cổ truyền để điều trị bệnh Viêm khớp dạng thấp, ung thƣ, lao, viêm vi khuẩn sinh mủ…Ở Trung quốc Việt nam, thuốc sắc nƣớc nóng loài dùng để điều trị nhờ hoạt tính chống virut chống ung thƣ, đặc biệt ung thƣ tuyến tiền liệt ngày [41] Một số nghiên cứu chiết xuất từ TNHC, xác với tên Trinh nữ Crila [16] thử nghiệm in vitro in vivo [8], [39], [40] Trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi đƣợc nuôi cấy chuột thực nghiệm cho thấy chất chiết hoạt hóa tế bào lympho T nuôi cấy chuột Balb/c Nhiều hoạt chất có tác dụng chống phân bào, ức chế phát triển tế bào ung thƣ đồng thời phục hồi chức miễn dịch Viên nang Crila biệt dƣợc Nguyễn Thị Ngọc Trâm, chiết từ Trinh nữ Crila đƣợc sản xuất từ alkaloid có hoạt tính sinh học Thuốc đƣợc đăng ký sản xuất, sử dụng rộng rãi Việt Nam số nƣớc để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt u xơ tử cung Ngoài ra, viên Crila đƣợc nghiên cứu sử dụng để điều trị thực nghiệm tế bào dòng ung thƣ vú, tử cung, dày, phổi, tuyến tiền liệt số bệnh nhân ung thƣ tự nguyện [17], [30] Các phân đoạn chứng minh có tác dụng tăng cƣờng miễn dịch chống ung thƣ mạnh (gồm alkaloid flavonoid) đƣợc chiết làm thành viên nén có tên Crilin T Các đặc tính hóa, lý tác dụng độc tính cấp, bán cấp…của thuốc đƣợc đánh giá Chúng tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng cƣờng miễn dịch in vitro mô hình bệnh nhân ung thƣ có suy giảm miễn dịch, cách nuôi cấy tế bào máu ngoại vi bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng giai đoạn muộn thử nồng độ thuốc khác theo dõi đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ dấu ấn biểu lộ IL-2, TNFα mức độ ARN protein phƣơng pháp RT-PCR ELISA cách tƣơng ứng Đề tài nhằm mục đích: Xác định biểu lộ IL-2 TNF-α mức độ mARN protein tế bào lympho nuôi cấy in vitro bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng giai đoạn muộn ngƣời bình thƣờng lâm sàng với hai liều thuốc khác Đánh giá tác dụng tăng cƣờng miễn dịch Crilin T so với Levamisol Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Trinh nữ hoàng cung Cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) đƣợc gọi Náng rộng, Tỏi rộng, Tây nam văn châu lan, Thập bát học sĩ - Crinum latifolium L., thuộc họ Náng Amaryllidaceae [18], [50] TNHC loài có thân nhƣ củ hành tây to, đƣờng kính 10-15 mm, bẹ úp vào thành thân giả dài khoảng 10-15 cm, có chiều mỏng kéo dài từ 80100 cm, rộng 3-8 cm, hai bên mép lƣợn sóng Gân song song mặt lõm thành rãnh, mặt dƣới có có sống rõ, đầu bẹ nơi sát đất có màu đỏ tím Hoa mọc thành tán gồm 6-18 hoa, cán dài 30-60 cm Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ [14], [41] Cây TNHC có nhiều nƣớc Đông Nam Á Nhật bản, gồm Việt Nam, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào [25], [31], [50] Ở Việt Nam mọc hoang ven suối rừng thƣờng phát triển mạnh vùng có khí hậu nóng khô từ Đà Nẵng đến tận mũi Cà Mau, đặc biệt số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai Bà Rịa - Vũng Tàu [9], [14], [18] Hình 1.1 Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 1.1.1 Phân biệt TNHC với náng khác Trong tự nhiên, có nhiều giống hình thái, đặc điểm thực vật…trong họ định Do đó, để phân biệt TNHC có tác dụng sinh học, tránh nhầm lẫn với náng khác giống với TNHC có Việt Nam, Nguyễn Thị Ngọc Trâm không dựa vào hình thái thực vật mà phân tích đặc tính di truyền (ADN) đặc trƣng TNHC có Việt Nam Theo Nguyễn Thị Ngọc Trâm, có loại náng khác giống với TNHC (Hình 1.1) mà tác giả chọn làm thuốc viên nang Crila Crilin T Cây đƣợc gọi với tên chi riêng “Trinh nữ Crila” đƣợc trồng thành nhiều điền trang Bình Dƣơng [16] Về hình dáng, TNHC có hình dáng bên giống với náng hoa trắng, huệ biển Thậm chí, TNHC có hình dáng bên giống với loại có tác dụng làm giảm khả sinh sản Sự nhầm lẫn nhiều tai hại, không giúp cho điều trị mà ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe Hình 1.2 Những khác họ với Crinum Một đặc điểm TNHC khác với náng hoa trắng náng hoa đỏ mép xoăn hình lƣợn sóng, họ cao hơn, to dài Hoa gồm cán dài 40-60 cm, to cỡ ngón tay cái, hoa tựa nhƣ hoa loa kèn to, có màu trắng màu hồng phấn từ cuống hoa trở lên độ ¼ hoa đẹp, nhƣng nhiều cuống không mang hoa mà bị đổ, trồng đất tốt, không đủ nắng TNHC nhƣ thuộc họ thuỷ tiên có hoa thơm, náng hoa trắng có hoa thơm Để phân biệt TNHC với Lan huệ chi Crinum, phải dựa khác hình thái thực vật Sự khác hình thái hai trình bày bảng sau: Bảng 1.1 So sánh TNHC Lan huệ Lan huệ TNHC - Hoa thơm - Hoa thơm - Cánh hoa mảnh, rộng, màu phớt hồng - Cánh hoa hẹp, màu trắng xanh - Nụ hoa chƣa nở phồng to, ngắn - Nụ hoa lúc chƣa nở thon dài - Số hoa thƣờng tán hoa, - Trên tán hoa thƣờng có 12 hoa có 9, 10, 12 - Chỉ nhụy hoa màu trắng - Chỉ nhụy hoa màu đỏ tía - Cuống hoa tròn, đế tán hoa cong, - Cuống hoa dài TNHC (10-12 cm), dài khoảng 7cm, đế hoa cuống hoa đế hoa cuống hoa màu đỏ tía màu xanh - Khi hoa nở hết, cánh hoa xếp sát giữ hình ống - Lá có màu xanh nhạt vàng - Khi hoa nở hết, cánh hoa tách rời ra, uốn cong xuống - Lá có màu xanh đậm hơn, dầy TNHC - Thân thƣờng ngắn, có màu đỏ tía - Thân cao hơn, thƣờng có màu xanh, có màu đỏ tía 1.1.2 Thành phần hóa học Crinum latifolium L Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản Việt Nam nghiên cứu thành phần hóa học náng có tên khoa học Crinum latifolium L [25], [26], [32], [39], [51] Thành phần alkaloid Crinum latifolium L + Crinum latifolium L Ấn Độ: 11-O-Acetylambelline, 11-O-Acetyl-1,2-epoxyambelline, Ambeline, Crinafolidine, Crinafoline, (-) 2-Epilycorine, 2Epipancrassidine, 1,2--epoxyambelline, Hippadine (Pratorine, Alkalois N3), Latindine, Latisodine, Latisoline (Latisodine-O--D-glucopyranosyl), (-) Lycorine, (-) Lycorine-1-0--glucoside, Pratorimine, Pratorinine, Pratosine, Pseudolycorine1-0--D-glucpside [25], [27] + Crinum latifolium L Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayne, (-) Acetyllycorine, Cherylline (S), (+) Crinamine, (-) Crinine (Vittatine, Crinidine), Hamayne (Bulbispermine, Demethylcrinamine), Hipeastrine, Latifine (S), Undulatine [31] Hình 1.3 Cấu trúc hóa học số Alkaloid [39] Powelline, + Cây TNHC Việt Nam với tên Trinh nữ Crila (Crinum latifolium L.): 9Octadecenamideb, Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine, Crinane-3--ol, Buphannidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6hydroxybuphannidrine, 1,2-epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine, Epoxy-3,7dimethoxycrinane-11-one, Lycorin Pratorin (Hippadin) flavonoid: 4’7dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan, kaemperol-3-O--glucopyranoside [9], [14],[17], [41] Thành phần hóa học khác Crinum latifolium L + Crinum latifolium L Nhật Bản có Glucan a Glucan b + Cây TNHC Việt Nam (Crinum latifolium L.) có 32 chất bay saponin, acid hữu cơ, amino acid, p-hydroxycinnamat dihydroxycinnamat ethyl, keampferol-3-4-di-O--D-glucopyranosit Bảng 1.2 Các hỗn hợp alkaloid TNHC [39] metyl, 3,4’- 1.1.3 Tình hình nghiên cứu TNHC Việt Nam Viên nang Crila đời từ cụm công trình nghiên cứu TNHC Nguyễn Thị Ngọc Trâm cộng nƣớc [30], [40] Viên nang Crila sản xuất từ alkaloid có hoạt tính sinh học chiết xuất từ TNHC, điều trị u xơ tử cung phì đại lành tính tuyến tiền liệt [40] Viên nang Crila đƣợc Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm định lƣợng hàm lƣợng alkaloid phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) [39] “Nghiên cứu định tính, định lượng crinamidin dược liệu viên nang TNHC phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” [2],[14], [18], [41] Viên thuốc Crila đƣợc sản xuất từ vùng trồng TNHC hay Trinh nữ Crila Công ty Thiên Dƣợc, Bình Dƣơng, đạt tiêu chuẩn GACP – WHO nhà máy Công ty TNHH Thiên Dƣợc đƣợc Cục quản lý dƣợc – Bộ Y tế cấp giấy chứng nhận đạt tiêu chuẩn GMP-WHO (Thực hành tốt nhà máy sản xuất thuốc), GLP (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc), GSP (Thực hành tốt bảo quản thuốc) [18] Thuốc đƣợc thử nghiệm lâm sàng bệnh viện trung ƣơng đƣợc hội đồng khoa học công nghệ - Bộ Y tế đánh giá với hiệu điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt đạt 89,18%, u xơ tử cung 79,5% [15] Thuốc Crila đƣợc ngƣời bệnh tin dùng hiệu điều trị cao, giá thành hợp lý, phù hợp với thu nhập đa số bệnh nhân đặc biệt bệnh nhân nghèo Từ sản phẩm đời chƣa thấy có ý kiến ngƣời bệnh tác dụng không mong muốn làm ảnh hƣởng đến sức khỏe chất lƣợng sống Ngoài sản phẩm thuốc Crila, cụm công trình nghiên cứu TNHC có thêm hai sản phẩm thực phẩm chức viên nang Crilin Trà túi lọc TNHC Sản phẩm Crila đời kết nghiên cứu từ Nhiệm vụ hợp tác quốc tế khoa học công nghệ theo Nghị định thƣ Việt Nam Bungari đƣợc chiết từ hoa TNHC Việt Nam Crila đƣợc chứng minh tác dụng chống oxy hóa tăng cƣờng chống khối u gián tiếp hay có tác dụng gây độc tế bào ung thƣ trực tiếp dòng ung thƣ phổi, ung thƣ vòm mũi họng, ung thƣ tuyến tiền liệt, gan, màng tim nghiên cứu in vitro in vivo [19], [40] Viên nén Crilin T (sản phẩm nghiên cứu) chọn từ hai thành phần chủ yếu alkaloid flavonoid (chƣa công bố) 1.2 Vai trò hệ thống đáp ứng miễn dịch ung thƣ 1.2.1 Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư Ung thƣ bệnh ác tính đƣợc sinh từ tế bào bình thƣờng bị biến đổi Các tế bào ác tính phát triển vô hạn định giết chết thể chủ Có nhiều chứng cho thấy đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ nhƣ: số ung thƣ tự thoái triển, có nhiều lympho đại thực bào thâm nhiễm khối u, thoái lui di sau loại bỏ khối u nguyên phát Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ cao sau ức chế miễn dịch, suy giảm miễn dịch (AIDS, trẻ sơ sinh, ngƣời già, bệnh nhân ghép tạng) Hệ miễn dịch tham gia bảo vệ thể hai chế [5], [7] - Cơ chế đề kháng tự nhiên thể (dịch thể hay tế bào) mà không cần mẫn cảm trƣớc với kháng nguyên (KN) ung thƣ Đây rào chắn bảo vệ, chúng có tầm quan trọng đặc biệt chống lại xuất di thông qua vai trò tế bào đại thực bào, NK, bạch cầu toan… - Cơ chế cảm ứng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với có mặt kháng nguyên ung thƣ tham gia tế bào miễn dịch nhƣ lympho T (Th, Ts, Tc), lympho B Đây trình phức tạp, chúng hoạt động điều hòa thông qua cytokine tạo nên loạt tín hiệu hoạt hóa cần thiết để nhận biết tiêu diệt tế bào ung thƣ 1.2.2 Suy giảm miễn dịch Suy giảm miễn dịch (SGMD) hay thiếu hụt miễn dịch nhƣ hệ thống, hoạt động bình thƣờng trƣờng hợp định nguyên nhân biết hay chƣa biết tổn thƣơng tiên phát hay thứ 10 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR TNFα lympho bệnh nhân ung thư vòm mũi họng nuôi cấy Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) Sản phẩm phản ứng RT-PCR biểu lộ mARN TNFα lympho bào bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng Hình 3.6 Các băng B2M tƣơng đƣơng nhau, hai nồng độ Crilin T cho biểu lộ nhiều so với nhóm chứng Nếu so sánh biểu lộ mARN TNFα bệnh nhân ngƣời thƣờng thấy Crilin T làm tăng biểu lộ TNFα 02 nhóm lympho bào ngƣời bệnh ngƣời bình thƣờng Đây tín hiệu cho thấy thuốc có tác dụng tốt việc kích thích miễn dịch Điều đƣợc chứng minh mức độ protein 52 3.6 So sánh biểu lộ protein gen IL-2 dịch nuôi cấy lympho bào đƣợc xác định ELISA Trong tế bào, thông tin quy định protein nằm nhiễm sắc thể nhân tế bào Thông tin đƣợc biểu lộ thông qua mARN đƣợc phát nhƣ Để biết biểu lộ mức độ protein, ngƣời ta dùng kỹ thuật xác định protein khác nhƣ WB, ELISA, hóa mô miễn dịch…Chúng dùng kỹ thuật ELISA để xác định protein IL-2 TNFα dịch nuôi cấy tế bào lympho ngƣời, kỹ thuật có độ nhạy cao Nhƣ mục đích với xác định biểu lộ gen Hình 3.7 So sánh biểu lộ IL-2 Levamisol với chứng âm bệnh nhân (p=0,045) Trong mẫu nuôi cấy lympho bào bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng Hầu hết Levamisol có tác dụng tăng tiết IL-2, nhiên chƣa cao nhiều so với nhóm chứng âm (Hình 3.7) Kết phù hợp với kết RT-PCR Điều cho thấy biểu lộ hai mức độ mARN protein đồng biến Sự khác biệt có ý nghĩa thông kê p