Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài này nhằm mục đích: Xác định biểu lộ của IL-2 và TNF-α ở mức độ mARN và protein của tế bào lympho nuôi cấy in vitro của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn và người bình thường về lâm sàng với hai liều thuốc khác nhau; đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol.
ĐẠI H ỌC QU ỐC GIA HÀ N ỘI ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰỰNHIÊN TRƯỜNG Đ ẠI H ỌC KHOA H ỌC T NHIÊN KHOA SƯ PHẠM KHOÁ LUẬ N TỐT NGHIỆP Phạm Huy Cường Đề tài: THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HỒNG CUNG Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Lớp: Hµ né i 2009 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội 2012 ĐẠI H ỌC QU ỐC GIA HÀ N ỘI ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰỰNHIÊN TRƯỜNG Đ ẠI H ỌC KHOA H ỌC T NHIÊN KHOA SƯ PHẠM Phạm Huy Cường KHOÁ LUẬ N TỐT NGHIỆP Đề tài: THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG Chuyên ngành : Sinh học thực Giáo viên hướng dnghi ẫn: ệmSinh viên thực hiện: Lớp: Mã số : 60 42 30 Hµ né i 2009 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VĂN ĐƠ Hà Nội 2012 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cán bộ hướng dẫn khoa học TS. Nguyễn Văn Đơ Phó chủ nhiệm bộ mơn Miễn dịch Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội người thầy đã tận tình chỉ bảo dẫn dắt tơi trong nghiên cứu khoa học, cùng tơi giải quyết nhiều khó khăn, vướng mắc trong q trình thực hiện luận văn, đóng góp những ý kiến q báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn này Tơi xin bày tỏ lòng q trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TSKH. Phan Thị Phi Phi người thầy đã tận tình chỉ bảo đóng góp những ý kiến q báu và tạo điều kiện tốt nhất cho tơi trong q trình học tập và nghiên cứu Tơi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Ngọc Trâm – Giám đốc Cơng ty TNHH Thiên Dược, tỉnh Bình Dương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về tình cảm cũng như kinh phí để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS. TS Phạm Đăng Khoa – Chủ nhiệm bộ mơn, PGS. TS Nguyễn Thanh Thúy – Phó chủ nhiệm bộ mơn, cùng tồn thể cán bộ, nhân viên Bộ mơn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi học tập và nghiên cứu Đồng thời, tơi xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể cán bộ, nhân viên khoa Xạ 3 Bệnh viện K Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn này Nhân dịp này, cho tơi được gửi lời cám ơn tới các thầy cơ Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Các thầy cơ đã cho tôi những kiến thức hết sức mới mẻ và cần thiết để tôi thấy thêm tự tin, bước tiếp trên con đường nghiên cứu khoa học Và trên hết, tôi muốn gửi tới lời cảm ơn chân thành nhất đến những người thân trong gia đình và bạn bè ln ở bên động viên, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian học tập và làm việc Chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 12 tháng 12 năm 2012 Học viên Phạm Huy Cường NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribonucleic AIDS : Acquired Immunodeficiency Syndrome ARN : Acid Ribonucleic B2M : Beta 2 microglobulin CD : Cluster of Differenciation cDNA : Complementary Deoxyribonucleic DDT : Ddopacchrome tautomerase dNTP : Deoxyribonucleotid Triphotphat EBV : Epstein Barr Virus ELISA : Enzyme – Linker Immunosorbent Assay HIV : Human Immunodeficiency Virus HLA : Human Leucocyte Antigen HPLC : High Perfomance Liquid chromatography IL2 : Interleukin – 2 IL2R : Interleukin – 2 Receptor KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể LGL : Larger gramilar lymphocyte MHC : Major Histocompatibility Complex NK : Natural Killer PCR : Polymerase Chain Reaction SCF : Stem cell factor SGMD : Suy giảm miễn dịch TNFα : Tumor Necrosis Factor alpha TNHC : Trinh nữ hoàng cung UTCTC : Ung thư cổ tử cung UTDD : Ung thư dạ dày UTVMH : Ung thư vòm mũi họng MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Cây Trinh nữ hoàng cung 3 1.1.1. Phân biệt cây TNHC với các cây náng khác 4 1.1.2. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. 7 1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam 10 1.2. Vai trò của hệ thống đáp ứng miễn dịch trong ung thư 11 1.2.1. Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư 11 1.2.2. Suy giảm miễn dịch 12 1.2.3. Ung thư vòm mũi họng 14 1.2.4. Nguyên nhân ung thư vòm 15 1.3. Tình hình nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 16 1.3.1. Vai trò của các cytokin 17 1.3.2. Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thư 21 1.3.3. Levamisole thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 29 1.3.4. Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC 29 Chương 2 32 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 33 2.2. Đối tượng nghiên cứu 33 2.2.1. Bệnh nhân 33 2.2.2. Người bình thường 34 2.2.3. Vật liệu nghiên cứu 34 2.3. Phương pháp nghiên cứu 35 2.3.1. Nuôi cấy tế bào lympho 35 2.3.2. Đếm số lượng bạch cầu và dòng bạch cầu lympho 36 2.3.3. Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy 37 2.3.4. Tổng hợp cADN 38 2.3.5. Kỹ thuật RTPCR 39 2.3.6. Sơ đồ nghiên cứu 45 2.3.7. Kỹ thuật ELISA định lượng IL2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào lympho 45 Chương 3 48 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48 3.1. Kiểm tra chất lượng ARN chiết tách được 48 3.2. Phản ứng RTPCR đơn mồi của gen B2M, IL2 và TNFα 49 3.3. Phản ứng RTPCR đa mồi của gen B2M với IL2/TNFα 50 3.4. Sự biểu lộ IL2 ở mức độ mARN của lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với thuốc thử 52 3.5. Sự biểu lộ mARN của TNFα ở lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử. 55 3.6. So sánh biểu lộ protein của gen IL2 ở dịch nuôi cấy lympho bào được xác định bởi ELISA 58 3.7. So sánh biểu lộ protein của gen TNFα ở dịch ni cấy có sử dụng các thuốc thử 64 (A) (B) 66 Sự biểu lộ TNFα ở mức độ mARN khơng có sự khác biệt giữa các nhóm chứng âm và dương. Sự biểu lộ này thấp hơn so với sự kích thích của Crilin T ở cả hai nồng độ 0,25mg và 0,5mg. Ở mức độ protein cũng cho kết quả tương tự (Hình 3.18A và hình 3.18B). Như vậy, các kỹ thuật ELISA và RTPCR đều cho kết quả tốt đối với sự biểu lộ TNFα 66 3.8. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với nhóm chứng dương Levamisol. 66 KẾT LUẬN 68 KIẾN NGHỊ 69 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. So sánh cây TNHC và cây Lan huệ 5 Bảng 1.2. Các hỗn hợp alkaloid của cây TNHC [39] 8 9 Bảng 2.1. Thành phần dung dịch PBS 35 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi 40 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR đa mồi 42 Bảng 2.4. Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn ADN cần phân tách 43 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.) 4 Hình 1.2. Những cây khác cùng họ với Crinum 4 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số Alkaloid [39] 8 Hình 3.1. RTPCR đơn mồi xác định biểu lộ các gen B2M, IL2 và TNFα ở các tế bào dòng chuẩn 50 Hình 3.2. Hình ảnh PCR đa mồi của cặp gen nội chuẩn. (A) Các băng được khuếch đại mARN của gen B2M và IL2; (B) B2M và TNFα. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker Fermentas) 52 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RTPCR của IL2 ở lympho người bình thường ni cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker Fermentas). 53 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RTPCR của IL2 ở lympho ni cấy của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker Fermentas). 54 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm RTPCR của TNFα ở lympho người bình thường ni cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker Fermentas). 56 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RTPCR của TNFα ở lympho bệnh nhân ung thư vòm mũi họng ni cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker Fermentas). 57 Hình 3.7. So sánh sự biểu lộ IL2 của Levamisol với chứng âm ở bệnh nhân (p=0,045). 58 Hình 3.8. So sánh nồng độ IL2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở tế bào bệnh nhân in vitro (p= 0,14) 59 Hình 3.9. So sánh nồng độ IL2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch ni cấy in vitro tế bào lympho từ bệnh nhân (p=0,39) 60 Hình 3.10. So sánh nồng độ IL2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in vitro (p=0,23) 60 Hình 3.11. So sánh sự biểu lộ Il2 của lympho được kích thích bởi Levamisol với chứng âm ở người thường (p=0,18). 61 Hình 3.12. So sánh nồng độ IL2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở dịch ni cấy người thường in vitro (p=0,42) 62 Hình 3.13. So sánh nồng độ IL2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch ni cấy người thường in vitro (p=0,30) 62 Hình 3.14. So sánh nồng độ IL2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình thường in vitro (p = 0,34) 63 Hình 3.15. So sánh nồng độ IL2 ở tế bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng và người bình thường in vitro 64 Hình 3.16. So sánh nồng độ TNFα ở liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in vitro (p=0,17) 65 Hình 3.17. So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình thường in vitro (p=0,42) 65 Hình 3.18. So sánh sự biểu lộ TNFα ở hai mức độ mARN và Protein ở tế bào lympho của cùng một người bình thường 66 Hình 3.18. So sánh sự biểu lộ TNFα ở hai mức độ mARN và Protein ở tế bào lympho của cùng một người bình thường 58 10 ... muộn và người bình thường về lâm sàng với hai liều thuốc khác nhau. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây Trinh nữ hồng cung Cây Trinh nữ hồng cung (TNHC) còn được gọi là Náng lá rộng, Tỏi lá... THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG Chuyên ngành : Sinh học thực Giáo viên hướng dnghi ẫn: ệmSinh viên thực hiện: Lớp: Mã số : 60 42 30 ... làm thành viên nén có tên là Crilin T. Các đặc tính hóa, lý và tác dụng độc tính cấp, bán cấp của thuốc đã được đánh giá. Chúng tơi tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro trên mơ hình bệnh nhân ung thư đã có suy giảm miễn dịch, bằng cách ni cấy tế bào máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư