Luận văn thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in vitrocủa các hóa phẩm cây trinh nữ hoàng cung

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro trên mô hình bệnh nhân ung thư đã có suy giảm miễn dịch, bằng cách nuôi cấy tế bào máu ngoại vi của bệnh nhân ung t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO

CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO

CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN VĂN ĐÔ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cán bộ hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Văn Đô - Phó chủ nhiệm bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội người thầy đã tận tình chỉ bảo dẫn dắt tôi trong nghiên cứu khoa học, cùng tôi giải quyết nhiều khó khăn, vướng mắc trong quá trình thực hiện luận văn, đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng quý trọng và biết ơn sâu sắc tới GS TSKH Phan Thị Phi Phi người thầy đã tận tình chỉ bảo đóng góp những ý kiến quý báu và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm – Giám đốc Công ty TNHH Thiên Dược, tỉnh Bình Dương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về tình cảm cũng như kinh phí để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Phạm Đăng Khoa – Chủ nhiệm bộ môn, PGS TS Nguyễn Thanh Thúy – Phó chủ nhiệm bộ môn, cùng toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ, nhân viên khoa Xạ 3 Bệnh viện K Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.

Nhân dịp này, cho tôi được gửi lời cám ơn tới các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Các thầy cô đã cho tôi những kiến thức hết sức mới mẻ và cần thiết để tôi thấy thêm tự tin, bước tiếp trên con đường nghiên cứu khoa học.

Và trên hết, tôi muốn gửi tới lời cảm ơn chân thành nhất đến những người thân trong gia đình và bạn bè luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc.

Chân thành cảm ơn!

Học viên

Phạm Huy Cường

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

ADN : Acid Deoxyribonucleic

AIDS : Acquired Immunodeficiency SyndromeARN : Acid Ribonucleic

EBV : Epstein Barr Virus

ELISA : Enzyme – Linker Immunosorbent AssayHIV : Human Immunodeficiency Virus

HLA : Human Leucocyte Antigen

HPLC : High Perfomance Liquid chromatographyIL-2 : Interleukin – 2

IL-2R : Interleukin – 2 Receptor

KN : Kháng nguyên

KT : Kháng thể

LGL : Larger gramilar lymphocyte

MHC : Major Histocompatibility Complex

NK : Natural Killer

PCR : Polymerase Chain Reaction

SCF : Stem cell factor

SGMD : Suy giảm miễn dịch

TNFα : Tumor Necrosis Factor alpha

TNHC : Trinh nữ hoàng cung

UTCTC : Ung thư cổ tử cung

UTDD : Ung thư dạ dày

UTVMH : Ung thư vòm mũi họng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Cây Trinh nữ hoàng cung 2

1.1.1 Phân biệt cây TNHC với các cây náng khác 3

1.1.2 Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L .6

1.1.3 Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam 9

1.2 Vai trò của hệ thống đáp ứng miễn dịch trong ung thư 10

1.2.1 Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư 10

1.2.2 Suy giảm miễn dịch 10

1.2.3 Ung thư vòm mũi họng 13

1.2.4 Nguyên nhân ung thư vòm 13

1.3 Tình hình nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 14

1.3.1 Vai trò của các cytokin 15

1.3.2 Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thư 19

1.3.3 Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch 26

1.3.4 Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC 26

Chương 2 29

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.2 Đối tượng nghiên cứu 29

2.2.1 Bệnh nhân 29

2.2.2 Người bình thường 30

2.2.3 Vật liệu nghiên cứu 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Nuôi cấy tế bào lympho 32

2.3.2 Đếm số lượng bạch cầu và dòng bạch cầu lympho 33

2.3.3 Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy 33

2.3.4 Tổng hợp cADN 34

2.3.5 Kỹ thuật RT-PCR 35

2.3.6 Sơ đồ nghiên cứu 41

2.3.7 Kỹ thuật ELISA định lượng IL-2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào lympho .41

Chương 3 44

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44

3.1 Kiểm tra chất lượng ARN chiết tách được 44

3.2 Phản ứng RT-PCR đơn mồi của gen B2M, IL-2 và TNFα 45

3.3 Phản ứng RT-PCR đa mồi của gen B2M với IL-2/TNFα 46 3.4 Sự biểu lộ IL-2 ở mức độ mARN của lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với

thuốc thử 483.5 Sự biểu lộ mARN của TNFα ở lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử .533.6 So sánh biểu lộ protein của gen IL-2 ở dịch nuôi cấy lympho bào được xác định bởi ELISA 563.7 So sánh biểu lộ protein của gen TNFα ở dịch nuôi cấy có sử dụng các thuốc thử 63 (A) (B) 65

Sự biểu lộ TNFα ở mức độ mARN không có sự khác biệt giữa các nhóm chứng âm và dương Sự biểu lộ này thấp hơn so với sự kích thích của Crilin T ở cả hai nồng độ 0,25mg và 0,5mg Ở mức độ protein cũng cho kết quả tương tự (Hình 3.18A và hình 3.18B) Như vậy, các kỹ thuật ELISA và RT-PCR đều cho kết quả tốt đối với

sự biểu lộ TNFα 653.8 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với nhóm chứng dương Levamisol 65KẾT LUẬN 67KIẾN NGHỊ 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh cây TNHC và cây Lan huệ 4

Bảng 1.2 Các hỗn hợp alkaloid của cây TNHC [39] 8

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch PBS 31

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR đơn mồi 37

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR đa mồi 38 Bảng 2.4 Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn ADN cần phân tách 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 3Hình 1.2 Những cây khác cùng họ với Crinum 4Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số Alkaloid [39] 7Hình 3.1 RT-PCR đơn mồi xác định biểu lộ các gen B2M, IL-2 và TNFα ở các tế bào

dòng chuẩn 46Hình 3.2 Hình ảnh PCR đa mồi của cặp gen nội chuẩn (A) Các băng được khuếch đại

mARN của gen B2M và IL-2; (B) B2M và TNFα Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) 48Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho người bình thường nuôi

cấy Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) .50Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho nuôi cấy của bệnh nhân

ung thư vòm mũi họng Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) .52Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho người bình thường

nuôi cấy Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) .54Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho bệnh nhân ung thư

vòm mũi họng nuôi cấy Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas) .55Hình 3.7 So sánh sự biểu lộ IL-2 của Levamisol với chứng âm ở bệnh nhân (p=0,045) 57Hình 3.8 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở tế bào bệnh nhân in

vitro (p= 0,14) 58Hình 3.9 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy in vitro tế

bào lympho từ bệnh nhân (p=0,39) 59Hình 3.10 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in

vitro (p=0,23) 59Hình 3.11 So sánh sự biểu lộ Il-2 của lympho được kích thích bởi Levamisol với chứng

âm ở người thường (p=0,18) 60Hình 3.12 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người

thường in vitro (p=0,42) 61Hình 3.13 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người

thường in vitro (p=0,30) 61Hình 3.14 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình

thường in vitro (p = 0,34) 62Hình 3.15 So sánh nồng độ IL-2 ở tế bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng và người bình

thường in vitro 63Hình 3.16 So sánh nồng độ TNFα ở liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in

vitro (p=0,17) 64Hình 3.17 So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình

thường in vitro (p=0,42) 64Hình 3.18 So sánh sự biểu lộ TNFα ở hai mức độ mARN và Protein ở tế bào lympho của

cùng một người bình thường 65

Hình 3.18 So sánh sự biểu lộ TNFα ở hai mức độ mARN và Protein ở tế bào lympho của

cùng một người bình thường 58

MỞ ĐẦU

Trinh nữ hoàng cung (THNC) là một loại cây thuốc được sử dụng là thuốc cổ truyền ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới [12] Hiện nay, người ta đã phát hiện đến 130 loài khác nhau, phân bố ở các nước nhiệt đới và hơn

150 alkaloid trong loài cây này đã được chiết tách [17], [18] TNHC (Crinium latifolium (L.) đã được dùng như loại thuốc y học cổ truyền để điều trị các bệnh Viêm khớp dạng thấp, ung thư, lao, viêm do vi khuẩn sinh mủ…Ở Trung quốc và Việt nam, thuốc sắc trong nước nóng của loài này vẫn dùng để điều trị nhờ hoạt tính chống virut và chống ung thư, đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt cho đến ngày nay [41] Một số nghiên cứu đã và đang chiết xuất từ lá cây TNHC, chính xác với tên

mới là Trinh nữ Crila [16] và thử nghiệm in vitro và in vivo [8], [39], [40] Trên các

tế bào đơn nhân máu ngoại vi được nuôi cấy và trên chuột thực nghiệm cho thấy các chất chiết hoạt hóa tế bào lympho T nuôi cấy và cả ở chuột Balb/c Nhiều hoạt chất

có tác dụng chống phân bào, ức chế phát triển tế bào ung thư đồng thời phục hồi chức năng miễn dịch

Viên nang Crila biệt dược của Nguyễn Thị Ngọc Trâm, chiết từ lá cây Trinh

nữ Crila được sản xuất từ các alkaloid có hoạt tính sinh học Thuốc này đã được đăng ký sản xuất, sử dụng rộng rãi ở Việt Nam và một số nước ngoài để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung Ngoài ra, viên Crila còn được nghiên cứu sử dụng để điều trị thực nghiệm các tế bào dòng ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi, tuyến tiền liệt và trên một số bệnh nhân ung thư tự nguyện [17], [30]

Các phân đoạn đã chứng minh là có tác dụng tăng cường miễn dịch và chống ung thư mạnh nhất (gồm các alkaloid và flavonoid) cũng đã được chiết và làm thành viên nén có tên là Crilin T Các đặc tính hóa, lý và tác dụng độc tính cấp, bán cấp…của thuốc đã được đánh giá Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng

cường miễn dịch in vitro trên mô hình bệnh nhân ung thư đã có suy giảm miễn dịch,

bằng cách nuôi cấy tế bào máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn và thử các nồng độ thuốc khác nhau và theo dõi đáp ứng miễn dịch chống ung thư bởi các dấu ấn biểu lộ IL-2, TNFα ở mức độ ARN và protein bằng phương pháp RT-PCR và ELISA một cách tương ứng Đề tài này nhằm mục đích:

1 Xác định biểu lộ của IL-2 và TNF-α ở mức độ mARN và protein của tế bào

lympho nuôi cấy in vitro của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn

và người bình thường về lâm sàng với hai liều thuốc khác nhau

2 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây Trinh nữ hoàng cung

Cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) còn được gọi là Náng lá rộng, Tỏi lá rộng,

Tây nam văn châu lan, Thập bát học sĩ - Crinum latifolium L., thuộc họ Náng

có khí hậu nóng khô từ Đà Nẵng đến tận mũi Cà Mau, đặc biệt là ở một số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa - Vũng Tàu [9], [14], [18]

Hình 1.1 Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

1.1.1 Phân biệt cây TNHC với các cây náng khác

Trong tự nhiên, có nhiều cây giống nhau về hình thái, đặc điểm thực vật…trong một họ nhất định Do đó, để phân biệt cây TNHC có tác dụng sinh học, tránh nhầm lẫn với các cây náng khác giống với cây TNHC có ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ngọc Trâm không chỉ dựa vào hình thái thực vật mà còn phân tích đặc tính di truyền (ADN) đặc trưng của cây TNHC có ở Việt Nam Theo Nguyễn Thị Ngọc Trâm, có 6 loại cây náng khác giống với cây TNHC (Hình 1.1) mà tác giả đã chọn làm thuốc viên nang Crila và Crilin T Cây này đã được gọi với tên chi riêng là

“Trinh nữ Crila” và được trồng thành nhiều điền trang ở Bình Dương [16]

Về hình dáng, TNHC có hình dáng bên ngoài rất giống với cây náng hoa trắng, cây huệ biển Thậm chí, TNHC còn có hình dáng bên ngoài rất giống với một loại cây có tác dụng làm giảm khả năng sinh sản Sự nhầm lẫn nhiều khi rất tai hại,

nó không những không giúp cho điều trị mà có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe

Hình 1.2 Những cây khác cùng họ với Crinum

Một đặc điểm của lá TNHC khác với các cây náng hoa trắng và náng hoa đỏ

là mép lá xoăn hình lượn sóng, trong khi 2 cây cùng họ cao hơn, lá to và dài hơn Hoa gồm 1 cán dài 40-60 cm, to cỡ ngón tay cái, hoa tựa như hoa loa kèn to, có màu trắng và màu hồng phấn từ cuống hoa trở lên độ ¼ hoa rất đẹp, nhưng nhiều khi cuống không mang nổi hoa mà bị đổ, nhất là trồng ở đất tốt, không đủ nắng TNHC cũng như các cây thuộc họ thuỷ tiên có hoa thơm, náng hoa trắng có hoa thơm hơn

Để có thể phân biệt cây TNHC với cây Lan huệ cùng chi Crinum, phải dựa

trên sự khác nhau về hình thái thực vật Sự khác nhau về hình thái giữa hai cây này trình bày trong bảng sau:

Bảng 1.1 So sánh cây TNHC và cây Lan huệ

- Nụ hoa chưa nở phồng to, ngắn.

- Số hoa thường là 6 trên một tán hoa,

có khi là 9, 10, 12

- Chỉ nhụy hoa màu trắng

- Cuống hoa tròn, đế tán hoa hơi cong,

dài khoảng 7cm, đế hoa và cuống hoa

màu xanh

- Khi hoa nở hết, các cánh hoa vẫn xếp

sát nhau giữ hình ống

- Lá có màu xanh nhạt hơi vàng

- Thân thường ngắn, có màu đỏ tía

- Nụ hoa lúc chưa nở thon dài hơn

- Trên một tán hoa thường có 12 hoa

- Chỉ nhụy hoa màu đỏ tía

- Cuống hoa dài hơn TNHC (10-12 cm),

đế hoa và cuống hoa màu đỏ tía

- Khi hoa nở hết, các cánh hoa tách rời nhau ra, uốn cong xuống

- Lá có màu xanh đậm hơn, lá dầy hơn

lá TNHC

- Thân cao hơn, thường có màu xanh, đôi khi cũng có màu đỏ tía

1.1.2 Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L

Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa

học của cây náng có tên khoa học Crinum latifolium L [25], [26], [32], [39], [51].

• Thành phần alkaloid của cây Crinum latifolium L.

+ Crinum latifolium L Ấn Độ: 11-O-Acetylambelline, 11-O-Acetyl-1,2-βepoxyambelline, Ambeline, Crinafolidine, Crinafoline, (-) 2-Epilycorine, 2-Epipancrassidine, 1,2-β-epoxyambelline, Hippadine (Pratorine, Alkalois N3), Latindine, Latisodine, Latisoline (Latisodine-O-β-D-glucopyranosyl), (-) Lycorine, (-) Lycorine-1-0-β-glucoside, Pratorimine, Pratorinine, Pratosine, Pseudolycorine-1-0-β-D-glucpside [25], [27]

-+ Crinum latifolium L Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayne, (-) Acetyllycorine,

Cherylline (S), (+) Crinamine, (-) Crinine (Vittatine, Crinidine), Hamayne (Bulbispermine, Demethylcrinamine), Hipeastrine, Latifine (S), Powelline, Undulatine [31]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số Alkaloid [39]

+ Cây TNHC Việt Nam với tên mới là Trinh nữ Crila (Crinum latifolium L.):

9-Octadecenamideb, Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine, Crinane-3-α-ol, Buphannidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6-hydroxybuphannidrine, 1β,2β-epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine, Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one, Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan, kaemperol-3-O-β-glucopyranoside

[9], [14],[17], [41].

• Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L.

+ Crinum latifolium L Nhật Bản có Glucan a và Glucan b.

+ Cây TNHC Việt Nam (Crinum latifolium L.) có 32 chất bay hơi và

saponin, acid hữu cơ, amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, dihydroxycinnamat ethyl, keampferol-3-4-di-O-β-D-glucopyranosit

3,4’-Bảng 1.2 Các hỗn hợp alkaloid của cây TNHC [39]

1.1.3 Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam

Viên nang Crila ra đời từ cụm công trình nghiên cứu về cây TNHC của

Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự trong và ngoài nước [30], [40] Viên nang Crila

được sản xuất từ các alkaloid có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ lá cây TNHC,

điều trị u xơ tử cung và phì đại lành tính tuyến tiền liệt [40] Viên nang Crila đã được Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm định lượng hàm lượng alkaloid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao (HPLC) [39] “Nghiên cứu định tính, định lượng crinamidin trong dược liệu và

viên nang TNHC bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” [2],[14], [18], [41]

Viên thuốc Crila được sản xuất từ vùng trồng TNHC hay Trinh nữ Crila của Công ty Thiên Dược, Bình Dương, đạt tiêu chuẩn của GACP – WHO và nhà máy của Công ty TNHH Thiên Dược đã được Cục quản lý dược – Bộ Y tế cấp giấy chứng nhận đạt tiêu chuẩn GMP-WHO (Thực hành tốt nhà máy sản xuất thuốc), GLP (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc), GSP (Thực hành tốt bảo quản thuốc) [18]

Thuốc này đã được thử nghiệm lâm sàng tại các bệnh viện trung ương và đã được hội đồng khoa học công nghệ - Bộ Y tế đánh giá với hiệu quả điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt đạt 89,18%, đối với u xơ tử cung là 79,5% [15] Thuốc Crila được người bệnh tin dùng vì hiệu quả điều trị cao, giá thành hợp lý, phù hợp với thu nhập của đa số bệnh nhân đặc biệt bệnh nhân nghèo Từ khi sản phẩm ra đời cho đến nay chưa thấy có ý kiến của người bệnh về tác dụng không mong muốn làm ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc chất lượng cuộc sống

Ngoài sản phẩm thuốc Crila, cụm công trình nghiên cứu về cây TNHC còn

có thêm hai sản phẩm thực phẩm chức năng viên nang Crilin và Trà túi lọc TNHC

Sản phẩm Crila ra đời là kết quả nghiên cứu từ Nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo Nghị định thư giữa Việt Nam và Bungari được chiết từ hoa và lá cây TNHC Việt Nam Crila đã được chứng minh tác dụng chống oxy hóa

và tăng cường chống khối u gián tiếp hay có tác dụng gây độc tế bào ung thư trực tiếp trên các dòng ung thư phổi, ung thư vòm mũi họng, ung thư tuyến tiền liệt, gan,

màng tim nghiên cứu in vitro và in vivo [19], [40].

Viên nén Crilin T (sản phẩm đang được nghiên cứu) được chọn từ hai thành phần chủ yếu là các alkaloid và flavonoid (chưa công bố)

1.2 Vai trò của hệ thống đáp ứng miễn dịch trong ung thư

1.2.1 Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư

Ung thư là bệnh ác tính được sinh ra từ các tế bào bình thường bị biến đổi Các

tế bào ác tính phát triển vô hạn định và sẽ giết chết cơ thể chủ Có nhiều bằng chứng cho thấy sự đáp ứng miễn dịch chống ung thư như: một số ít ung thư tự thoái triển,

có rất nhiều lympho và đại thực bào thâm nhiễm khối u, thoái lui của di căn sau khi loại bỏ các khối u nguyên phát Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cao hơn sau ức chế miễn dịch, suy giảm miễn dịch (AIDS, trẻ sơ sinh, người già, bệnh nhân ghép tạng) Hệ miễn dịch tham gia bảo vệ cơ thể bằng hai cơ chế [5], [7]

- Cơ chế đề kháng tự nhiên của cơ thể (dịch thể hay tế bào) mà không cần mẫn cảm trước với kháng nguyên (KN) ung thư Đây là rào chắn đầu tiên của sự bảo vệ, chúng có tầm quan trọng đặc biệt chống lại sự xuất hiện của di căn thông qua vai trò của các tế bào đại thực bào, NK, bạch cầu ái toan…

- Cơ chế cảm ứng một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với sự có mặt của kháng nguyên ung thư và sự tham gia của các tế bào miễn dịch như lympho T (Th, Ts, Tc), lympho B Đây là một quá trình phức tạp, chúng hoạt động và điều hòa thông qua các cytokine tạo nên một loạt các tín hiệu hoạt hóa cần thiết để nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư

1.2.2 Suy giảm miễn dịch

Suy giảm miễn dịch (SGMD) hay thiếu hụt miễn dịch cũng như mọi hệ thống, ngoài sự hoạt động bình thường thì trong những trường hợp nhất định do những nguyên nhân đã biết hay chưa biết do những tổn thương tiên phát hay thứ phát của một cấu thành nào đó mà dẫn đến những rối loạn Cho nên, hệ thống miễn dịch có thể hoạt động một cách quá mức gây nên tình trạng quá mẫn, hay hoạt động

yếu không đạt yêu cầu gọi là thiểu mẫn, thiểu năng miễn dịch hay suy giảm miễn dịch (SGMD) Như vậy SGMD là tình trạng của cơ thể sống trong đó hệ thống miễn dịch hoạt động yếu, không đáp ứng được yêu cầu của cuộc sống đời thường mà cụ thể là chống lại các vi sinh vật gây bệnh, dẫn tới hậu quả phổ biến nhất là cơ thể bị nhiễm trùng nặng, đưa đến tử vong Dưới góc độ miễn dịch sinh lý bệnh thì SGMD

có thể phân chia ra 2 nhóm lớn [10]

- SGMD bẩm sinh hay tiên phát mà nguyên nhân gây ra là do di truyền

- SGMD mắc phải hay thứ phát thường là hậu quả của một quá trình bệnh lý khác ảnh hưởng đến hoạt động của hệ thống miễn dịch

* Suy giảm miễn dịch tiên phát có thể gặp:

- SGMD nguy kịch do thiếu hụt cả dòng tế bào lympho T và dòng tế bào

lympho B thường chết ở trẻ sơ sinh SGMD do thiếu hụt lympho B (hội chứng Bruton) Đây là bệnh di truyền ở nam giới, trẻ em bị bệnh thường phát hiện sau 6 tháng (trẻ không tự tạo kháng thể) Trường hợp này điều trị phải tiêm γglobulin và sống trong môi trường sạch SGMD do thiếu hụt lympho T (hội chứng Digeorge) Đây là bệnh do rối loạn hình thành tuyến ức, tế bào lympho T giảm dẫn đến rối loạn quá trình miễn dịch qua trung gian tế bào và cả miễn dịch dịch thể Trường hợp này điều trị phải ghép tuyến ức Ngoài ra, SGMD bẩm sinh còn có biểu hiện ở dòng tế bào thực bào và sản xuất bổ thể

* SGMD thứ phát (mắc phải):

Là một trạng thái bệnh lý rất hay gặp không chỉ ở các nước đang phát triển

mà kể cả những nước đã phát triển Nó là hiện tượng hay thấy, thứ phát sau nhiều bệnh, nhất là các bệnh gây suy dinh dưỡng, sau nhiễm độc một số thuốc gây ức chế miễn dịch, nhiễm trùng kéo dài hay tia xạ để điều trị ung thư, do nhiễm HIV hay do chính tế bào ung thư tiết ra các chất có hoạt tính ức chế miễn dịch

- SGMD thứ phát do suy dinh dưỡng: rất phổ biến ở các nước kinh tế thấp thuộc diện nghèo như nước ta Do đó nên thiếu protein dẫn đến thiếu nguyên liệu để

tổng hợp kháng thể, thiếu các yếu tố vi lượng đặc biệt là kẽm vì kẽm rất cần cho phát triển tuyến ức.

- SGMD thứ phát do nhiễm khuẩn:Trong tất cả các trường hợp nhiễm nếu kéo dài đều có thể gây ra tình trạng suy dinh dưỡng ở các mức độ khác nhau Một số loại virut như sởi bám trên bề mặt lympho T và B làm các tế bào này không nhận diện được kháng nguyên gây ức chế miễn dịch Một số vi khuẩn như tụ cầu vàng (staphylocoscus aureus) sinh ra một protein A có tác dụng gây ra hiện tượng ngưng tập các kháng thể dẫn đến bị các đại thực bào nuốt Nhiễm khuẩn kinh diễn đặc biệt nhiễm nội tế bào như trong bệnh lao, bệnh phong thì bao giờ cũng gây SGMD tế bào

Nhiễm virut HIV và bệnh AIDS đã và đang là con bệnh của thế kỷ Virus HIV tấn công vào tế bào lympho TCD4 và gây SGMD chung do vai trò kích thích miễn dịch của TCD4

- SGMD thứ phát do các bệnh ác tính như ung thư phát triển chiếm dinh dưỡng trong cơ thể và cơ thể tiết rất nhiều các chất hòa tan gây SGMD như TNF (Tumor necrosis factor - yếu tố hoại tử u)… Các ung thư xảy ra ở hệ lympho càng gây SGMD do giảm chức năng dòng tế bào này

- SGMD thứ phát do dùng các thuốc ức chế miễn dịch kéo dài sau ghép tạng Các thuốc chống ung thư…, làm giảm tăng sinh tế bào lympho T hay giảm tiếp nhận interleukin 2

- SGMD do tia xạ: tia xạ gây phá hủy các tế bào có thẩm quyền miễn dịch gây SGMD

- SGMD do một số bệnh khác như: bệnh suy thận kết hợp với suy dinh dưỡng vừa do mất protein qua nước tiểu vừa do nhiễm độc bởi các chất độc không thải ra ngoài được cũng thường có SGMD Thận hư nhiễm mỡ cũng gây SGMD

- SGMD do chấn thương thực thể hay tâm lý do có mối quan hệ thần kinh nội tiết với hệ miễn dịch

- SGMD do thầy thuốc: do sử dụng quá mức các phương tiện điều trị như tia

xạ, hóa chất điều trị ung thư…

- SGMD do tuổi già: sự SGMD ở người già là quy luật và thay đổi tùy từng

cá thế [11]

1.2.3 Ung thư vòm mũi họng

Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là bệnh đứng hàng đầu trong các ung thư khu vực tai mũi họng - đầu mặt cổ UTVMH là bệnh mang đặc điểm vùng Trên thế giới hình thành 3 khu vực địa lý, ở tỷ lệ mắc bệnh hoàn toàn khác nhau

Khu vực có nguy cơ cao nhất là phía Nam Trung Quốc và Đông Nam Á với

tỷ lệ mắc từ 30 - 80/100.000 dân/năm Khu vực có nguy cơ thấp bao gồm Châu Âu,

Mỹ, với tỷ lệ mắc 0,7 - 1/100.000 dân/năm và đứng ở giữa là vùng có nguy cơ mắc trung bình nhưng ngày càng có xu hướng tăng lên Đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee với tỷ lệ 8 - 12/100.000 dân/năm So sánh với các thống kê dịch tễ học ở các nước Đông Nam Á, Việt Nam có tỷ lệ UTVMH cao trung bình, chiếm 4,9% các ung thư thường gặp, sau Singapore (18,2%) và Philippin (6,3%) [3]

1.2.4 Nguyên nhân ung thư vòm

Nguyên nhân gây ra UTVMH cho tới nay chưa xác định rõ ràng qua các tài liệu nghiên cứu của nhiều tác giả thấy bệnh này có mối quan hệ với các yếu tố sau:

1.2.2.1 Yếu tố di truyền

Đã có nhiều trường hợp ung thư vòm họng được phát hiện trong một gia đình được nhiều tác giả mô tả (Nevo 1971, Hồ 1972, Lannier 1993) Theo thống kê của Hiệp hội Quốc tế chống ung thư (UICC) 1993: 70% căn nguyên ung thư xuất hiện

có liên quan tới yếu tố môi trường, 30% căn nguyên nội sinh trong đó có yếu tố di truyền bẩm sinh Tỷ lệ tăng cao của khàng nguyên HL-A2 ở vị trí thứ nhất và sự thiếu hụt ở vị trí thứ 2 của kháng nguyên BW 46 (gọi là Sin 2) hình như tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện ung thư vòm họng [4]

1.2.2.2 Các yếu tố môi trường

* Virus

Từ năm 1980 Degranges và cs cho thấy bệnh này có mối quan hệ đặc biệt với virus Epstein - Barr (EBV) Người ta thấy tỷ lệ kháng thể virus Epstein - Barr

và IgA/EA dương tính được dùng như một test lâm sàng để sàng lọc phát hiện UTVMH Ở Việt Nam theo Phan Thị Phi Phi và cộng sự cũng thấy tỷ lệ IgA/VCA dương tính 96% trên những bệnh nhân UTVMH loại ung thư mô không biệt hóa [3], [7], [22], [29]

* Các yếu tố môi trường khác

Kiểu dân Trung Quốc di tản sang Mỹ ít bị ung thư vòm họng hơn ở trong nước, làm cho người ta nghĩ tới vai trò của yếu tố môi trường có ảnh hưởng đến căn bệnh này Theo Ung thư học lâm sàng 1993, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là nguyên nhân gây ra viêm nhiễm mãn tính đường hô hấp trên nhất là ở trẻ em Người ta coi

đó là biểu hiện ở viêm EBV mãn tính, dịch sốt rét toàn phát gây ra suy giảm miễn dịch có lẽ cũng có vai trò trong căn bệnh này Tổn thương chức năng tế bào lympho

T kèm theo nhiễm EBV mạn tính là yếu tố nguy cơ cao đã được xác định [11]

1.2.2.3 Thức ăn và cách chế biến

Trong các thức ăn chế biến qua khâu lên men như rượu, bia, cà muối, dưa muối, xì dầu, nước mắm có chứa chất Nitrosamin, chất này có liên qua đến một số loại bệnh ung thư, trong đó có ung thư vòm họng

Ở Việt Nam theo Đặng Hanh Phức và cộng sự 1983 về điều tra tính chất Nitrosamin trong môi trường thực phẩm và trong cơ thể con người đã thấy Nitrosamin có mối quan hệ với tỷ lệ mặc một số loại ung thư cao ở một số vùng trong đó có ung thư vòm họng

Ung thư vòm mũi họng cũng như các loại ung thư khác ở giai đoạn muộn đều

có sự suy giảm miễn dịch [5] Đây là một mô hình tốt để nghiên cứu về tác dụng

kích thích miễn dịch của thuốc hoặc các chất tăng cường miễn dịch in vitro [6].

1.3 Tình hình nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm miễn dịch

Tình trạng suy giảm miễn dịch có thể gặp ở hầu hết các loại bệnh lý do đó

phạm vi chỉ định dùng thuốc kích thích miễn dịch rất rộng rãi Vì vậy từ khi phát hiện ra chất kích thích miễn dịch thì các nghiên cứu về chúng phát triển cả về chiều rộng lẫn chiều sâu Từ chỗ chỉ là đề tài nghiên cứu ở một số trung tâm nghiên cứu miễn dịch ở các nước phát triển thì hiện nay hầu hết các trung tâm nghiên cứu miễn dịch ở các nước đều đã nghiên cứu về các loại thuốc có tác dụng kích thích miễn dịch, điều hòa miễn dịch và đã thu được nhiều kết quả Những chất kích thích miễn dịch được nghiên cứu cũng phong phú từ nguồn các chất sinh học, hóa học, vi sinh vật, thực vật Các vị thuốc, bài thuốc có nguồn gốc tự nhiên cũng rất được chú ý và

có nhiều hứa hẹn Đến nay các chất kích thích miễn dịch mới ngày càng nhiều, tên của các chất và số lượng của chúng không thể kể hết, nhiều loại thuốc mới đã có mặt trên thị trường đã được đặt trong nhóm thuốc kích thích miễn dịch như: lipacol, unjex, dogarlic Mặc dù vậy việc tìm kiếm chất kích thích miễn dịch mới vẫn là một hướng quan trong vì hiện nay tình trạng kháng kháng sinh xảy ra nhanh và phổ biến, vì bệnh lý miễn dịch rất phức tạp, đa dạng nên các chất có khả năng giúp điều chỉnh các rối loạn ấy cần có nhiều đặc tính khác nhau để áp dụng cho từng trường hợp cụ thể Điều quan trọng hơn là do chúng ta chưa thực sự sản xuất được nhiều thuốc kích thích miễn dịch có hiệu lực cao, có thể điều trị tốt bệnh lý SGMD trên lâm sàng với với phương thức sử dụng an toàn, tiện lợi, giá thành thấp

Ở nước ta gần đây có một số công trình nghiên cứu về thuốc kích thích miễn dịch chủ yếu từ những cây thuốc như: TNHC, đương qui, ba kích, đỗ trọng, cam thảo, vỏ đỗ xanh…

1.3.1 Vai trò của các cytokin

Một hệ thống phức tạp như hệ thống miễn dịch muốn hoạt động được cần phải có sự tương tác giữa các tế bào Để thực hiện được sự tương tác, các tế bào đó phải nhận biết được và truyền đi các thông tin, với vai trò trung gian của các thụ thể Các thông tin được mang tới bởi những protein hay peptid rất nhỏ gọi là cytokin [13]

* Hoạt tính sinh học và chức năng

Các cytokin đều là các chất trung gian hòa tan, có tác dụng khởi động đáp ứng miễn dịch và phản ứng viêm Chức năng sinh học chung của các cytokin là trung gian trao đổi thông tin giữa các tế bào Các cytokin có hoạt tính rất mạnh, ở nồng độ femtomolar (10-15M) nó đã có tác dụng sinh học

Một trong những tác dụng quan trong của cytokin là điều hòa miễn dịch Hệ miễn dịch được điều hòa bằng một loạt các cơ chế như quá trình điều hòa bằng kháng nguyên, các globulin miễn dịch, thụ thể bề mặt tế bào lympho T (TCR), các

tế bào lympho T hỗ trợ (Th), tế bào lympho T ức chế (Ts),… Các cytokine có tác dụng tăng cường hoặc ức chế đáp ứng miễn dịch Tác dụng của các cytokin thường không đặc hiệu Các cytokin có tác dụng kích thích thường thông qua việc thành lập các vòng khếch đại để làm tăng số lượng các lympho đặc hiệu với một kháng nguyên nào đó và huy động được nhiều cơ chế hiệu lực cần thiết để loại trừ kháng nguyên đó Có thể nêu ví dụ một số cytokine như sau

Tế bào lympho TCD4 tiết Interleulin 4 (IL-4) làm tăng biểu lộ các phân tử MHC lớp II trên tế bào B, làm tăng tương tác giữa các tế bào Th có cùng MHC giống với các tế bào B Một số tế bào lympho T gây độc (CTL) có hoạt tính giới hạn bởi các phân tử MHC lớp I, tiết IFNγ và TNF là các cytokin làm tăng biểu lộ các phân tử MHC lớp I trong các tế bào đích, vì vậy nó tăng cường tương tác giữa CTL và các tế bào đích

* Cơ chế tác dụng

Khi một kháng nguyên trên màng của vi khuẩn hoặc virus xâm nhập vào trong cơ thể, nó bị bắt giữ bởi các tế bào thuộc hệ thống miễn dịch, trong đó có các

tế bào mono và đại thực bào – những tế bào tiêu hóa và trình diện kháng nguyên Người ta thấy những tế bào này ở da, niêm mạc, phổi hoặc máu, các cơ quan đóng vai trò như những hàng rào đầu tiên để bảo vệ cơ thể Khi kháng nguyên đã bị tế bào trình diện thực bào, nó bị tiêu hóa – nghĩa là bị chia ra từng đoạn và được kết hợp với những phân tử kháng nguyên của phức hợp phù hợp mô chủ yếu (MHC) nằm trên màng tế bào trình diện kháng nguyên Lympho T có các thụ thể đặc biệt của màng, đặc hiệu đối với kháng nguyên nhận biết được kháng nguyên trong giới hạn của phân tử MHC trên bề mặt tế bào trình diện Sự tương tác này gây lên một

“cuộc đối thoại” đầu tiên giữa các tế bào qua vai trò trung gian của các cytokin IFNγ được sản xuất ra bởi lympho T có tác dụng làm tăng bộc lộ các phân tử MHC trên bề mặt các tế bào trình diện kháng nguyên Các tế bào này sản xuất IL-1 có tác dụng hoạt hóa các tế bào lympho T Các lympho T được hoạt hóa sẽ sản xuất ra một lymphokin hoặc interleukin, được đánh số lần lượt theo thứ tự phát hiện ra chúng: Interleukin 1, 2, 3, 4, 5, 6… Các interleukin này có những ảnh hưởng trên các tế bào của hệ thống miễn dịch và ngay cả trên các tế bào khác Thí dụ các tế bào hệ thống thần kinh

Các cytokin, sau khi được giải phóng sẽ gắn lên các thụ thể bề mặt tế bào, làm biến đổi quá trình sao chép gen (ARN) và quá trình dịch mã gen (tổng hợp protein, enzyme, hocmon…) Các cytokin được coi như peptid nội tiết, nhưng khác với các nội tiết tố, phần lớn các cytokin tác dụng tại chỗ trong phạm vi môi trường nhỏ bé xung quanh các tế bào tiết ra chúng

Cytokin được sản xuất tại chỗ và nhất thời, chịu sự điều hòa chặt chẽ bởi sự

có mặt của chất lạ, tiếp đó bị phân hủy một cách nhanh chóng như một phương thức

tự điều hòa Do cytokin là các chất có thời gian bán hủy ngắn và thường khó phát hiện trong máu, vì vậy, để phát hiện và định lượng cần áp dụng các kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

* Phân loại các cytokin:

Có rất nhiều loại cytokin, mỗi loại tham gia những chức năng riêng biệt của

tế bào Dựa vào đích tác dụng hay chức năng mà người ta phân ra các loại như sau: Cytokin của phản ứng viêm: TNFα, TNFβ, IL-1α, TL-1β, IL-6 Cytokin chống virus

và chống phân triển: IFNα, IFNβ Một số cytokin tham gia đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (Th1) gồm nhóm làm tăng cường: IL-2, IFNγ, IL-15 và nhóm ức chế miễn dịch: IL-10 Đối với miễn dịch dịch thể cytokin làm tăng cường là (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 còn nhóm ức chế là IFNγ, IL-12 Ngoài tác dụng tăng cường hay ức chế miễn dịch, có cytokin còn tham gia vào quá trình tạo máu gồm tăng cường: yếu tố tế bào gốc (SCF = stem cell factor), IL-3, IL-11, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, erythroprotein và nhóm ức chế TGFβ và điều biến: IL-4 – bạch cầu ái kiềm và tế bào Mast, IL-5 – bạch cầu toan, IL-7 – tế bào lympho T và B, IL-11 – mẫu tiểu cầu

* Ý nghĩa của các xét nghiệm cytokin

Nhờ những tiến bộ nhanh chóng của của khoa học kỹ thuật, ngày nay hay nhiều loại phân tử tham gia vào các đáp ứng miễn dịch, trong đó có các cytokin (lymphokin, monokin), đã có thể định lượng được trong huyết thanh, trong dịch nuôi tế bào lympho, ngay cả từng tế bào lympho riêng rẽ

Các dấu ấn trong huyết thanh phản ánh hoạt tính của nhiều loại tế bào miễn dịch trong cơ thể Như vậy, đo lường các sản phẩm của tế bào miễn dịch có thể cho

ta những thông tin về trạng thái miễn dịch mà các phương pháp hình thái học khác (xét nghiệm tế bào lympho máu ngoại biên, sinh thiết một tổ chức, cơ quan…) không có khả năng cung cấp Phần lớn các loại phân tử được xét nghiệm hiện nay là sản phẩm tận của một chuỗi các quá trình hoạt động tế bào Mức tăng cao trong huyết thanh hay trong dịch nuôi cấy nói lên sự tăng sản xuất và tăng hoạt hóa của các hệ thống tế bào này Đa số các cytokin hiện được dùng như các dấu ấn cho biết tình trạng hoạt hóa miễn dịch hơn là sự suy giảm miễn dịch Các mức tăng cao của cytokin có liên quan đến mức độ hoạt động của bệnh Vì vậy, xét nghiệm các dấu ấn

này có giá trị trong đánh giá mức độ nặng của bệnh, theo dõi diễn biến là tiên lượng bệnh cũng như đánh giá kết quả của điều trị.

1.3.2 Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thư

1.3.2.1 Interleukin-2 (IL-2)

Năm 1976 một lymphokin gây phân bào giúp cho lympho bào tăng sinh và duy trì trong các mẫu nuôi cấy lympho T bình thường gọi là IL-2 IL-2 là một polypeptide có 133 acid amin và TLPT khoảng 15kD do tế bào Th1 hoạt hóa sản xuất ra Các tế bào T nghỉ không sản xuất IL-2 một cách tự phát nhưng khi được hoạt hóa bởi các kháng nguyên hay các chất kích thích đa clon ví dụ như các lectin (con-A hay PHA) lại sản xuất IL-2 [24], [36]

* Điều hòa nội bào trong sản xuất IL-2

Sự sao chép và dịch mã xảy ra trước sự sản xuất IL-2 nội bào (là chất được bài tiết ngay tức khắc vào môi trường nuôi cấy) Một giờ sau khi các tế bào lympho

Th bình thường của người bị biến chuyển bởi kích thích của PHA; mARN của IL-2 bắt đầu được tích lũy, đạt đỉnh cao trong vòng 8 giờ rồi bắt đầu giảm xuống Rất ít hoạt tính IL-2 được tìm thấy ở các tế bào lympho bình thường không bị kích thích

Tiếp theo sự dịch mã, IL-2 được chuyển đến các microxom Điều đó chứng

tỏ có lẽ chúng được khu trú trong các khoang microxom Khoảng 4 – 6 giờ sau kích thích bắt đầu đo được IL-2 ở ngoài tế bào và đạt đỉnh cao trong vòng 24 – 48 giờ

Sự sản xuất IL-2 hình như xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn G1 của chu kỳ tế bào

* Receptor với IL-2

Mỗi cytokin tương ứng với một hay nhiều receptor khác nhau, trong đó đáng chú ý nhất là receptor với IL-2 hay IL-2R Có 3 dạng IL-2R chủ yếu dựa vào ái tính gắn với IL-2, ba dạng đó là IL-2Rα, β, γ

- IL-2Rα được phát hiện bởi kỹ thuật đơn clon chống Tac (CD25), TLPT 55

kD gồm 251 acid amin

- IL-2Rβ có TLPT 75 kD gồm 286 acid amin gồm 1 domain nội bào tương

- Gần đây Takeshita, Sugamura và cs đã phát hiện ra IL-2R receptor thứ ba (IL-2Rγ), có TLPT 64 kD đóng vai trò then chốt trong việc tạo điều kiện thuận lợi cho việc gắn IL-2 bởi IL-2Rβ.

Khi IL-2Rα biểu lộ đơn sẽ cảm ứng việc gắn IL-2 có ái lực thấp không có khả năng vận chuyển tín hiệu Khi IL-2Rβ biểu lộ đơn độc trên bề mặt của những tế bào NK, gần như không gắn được IL-2 được như đã miêu tả và không hoạt hóa được tế bào T Nhận xét này gợi ý rằng, phải có một cấu trúc phức tạp hơn để tạo nên bởi liên kết giữa IL-2Rβ với những protein khác, làm thay đổi cấu hình, từ đó dẫn đến thay đổi ái tính gắn dính với nó Takeshita và cs đã chứng minh rằng IL-2Rγ có thể thực hiện được chức năng này Quá trình hoạt hóa tế bào T gồm 3 bước:

Bước 1: IL-2Rα và IL-2Rβ có thể tương tác với sự vắng mặt của IL-2 Chúng tạo thành phức hợp ái tính cao “giả”, có khả năng gắn IL-2 Số lượng vượt trội của IL-2Rα sẽ thúc đẩy sự cân bằng theo hướng tạo thành những phức hợp này Thêm nữa IL-2R có ái tính cảo khởi động những tín hiệu vận chuyển, làm tăng sự tổng hợp IL-2Rα IL-15 nhận biết IL-2Rβ có thể cạnh tranh (ganh đua) với việc tạo thành phức hợp này

Bước 2: IL-2Rγ sẽ gắn với phức IL-2Rαβ + IL-2 tạo thành IL-2 có ái tính cao Bằng cách gắn với IL-2Rγ, IL-4, 7, 9, 15 có thể cạnh tranh âm với việc tạo thành IL-2R có ái tính cao

Bước 3: IL-2Rα bị giáng hóa, sự tổng hợp IL-2 bị giảm bớt Phức hợp lúc này bị tách ra và tế bào lympho T mất nhạy cảm với IL-2

Các tế bào lympho T nghỉ chỉ có một ít chuỗi α và hầu như không có chuỗi

β Những receptor có ái tính cao với IL-2 là phức hợp αβγ có khả năng gây cảm ứng

sự tăng trưởng các tế bào Receptor có ái tính trung gian chỉ có chuỗi β đơn không hoạt hóa được tế bào lympho T

Như vậy tế bào biểu lộ IL-2Rβ và IL-2Rγ như tế bào NK, tế bào mono sẽ cảm ứng việc gắn IL-2R có ái tính trung gian trong khi những tế bào biểu lộ cả 3 (αβγ) như

tế bào lympho T hoạt hóa sẽ biểu lộ receptor có ái lực gắn cao Đa số những tế bào

lympho T nghỉ, tế bào lympho B, LGL và mono không biểu lộ IL-2Rα nhưng chúng có thể xảy ra sự biểu lộ receptor này Đa số LGL (Langer gramilan lymphocyte) biểu lộ chủ yếu IL-2Rβ và IL-2Rγ nhưng một số nhỏ dưới nhóm của LGL, 1% tế bào mono trình diện biểu lộ cả CD56 và IL-2Rα Thêm IL-2 vào LGL sẽ tăng cường hoạt tính diệt của tế bào NK và dẫn tới sự hình thành LAK biểu lộ IL-2Rα.

Ngược lại với việc ít biểu lộ IL-2Rα ở tế bào nghỉ bình thường, IL-2Rα được biểu lộ bởi những tế bào bất thường ở những bệnh nhân Leukemia; bệnh nhân tự miễn và liên quan với ghép dị gen Thêm nữa, những bệnh nhân này, có tăng nồng

độ IL-2Rα hòa tan trong huyết thanh được giải phóng từ tế bào hoạt hóa [46]

* Đáp ứng với IL-2

Khi tế bào lympho T bị kích thích bởi lectin hay kháng nguyên, một số tế bào sản xuất IL-2, một số trở thành đáp ứng với IL-2, hoặc vừa sản xuất vừa đáp ứng IL-2 từ dịch nổi có thể được sử dụng bởi các tế bào lympho T hoạt hóa chứ không phải tế bào lympho T nghỉ Các IL-2R trên màng tế bào lympho T hoạt hóa được xem như nơi đáp ứng của tế bào lympho với IL-2 Khoảng 6 giờ sau khi cho thêm một tín hiệu bên ngoài, các tế bào lympho bắt đầu biểu lộ các IL-2R Song nếu không có IL-2 thì không có tăng sinh xuất hiện, các tế bào ở trong giai đoạn G1 (chỉ sản xuất IL-2)

Số lượng IL-2R tăng tối đa sau 2 – 3 ngày và giảm thấp nhất sau 6 ngày (không phát hiện được) Khi ấy sự tăng trưởng ngừng, các tế bào giữ giai đoạn G1, kết quả này xuất hiện ngay cả khi có mặt IL-2 với nồng độ cao

Tuy nhiên, nếu bổ xung lần thứ hai một tín hiệu bên ngoài, lại kích thích sự xuất hiện với số lượng tối đa các IL-2R trên mặt tế bào, các tế bào này lại tăng trưởng khi có mặt IL-2 Hiện tượng này có thể lặp lại nhiều lần Các tín hiệu cần để cảm ứng các receptor có ái tính cao với IL-2 bao gồm các kích thích ngoại sinh (các kháng nguyên hoặc các kích thích đa clon) và nhiều kích thích nội sinh

IL-2 được nhận dạng là một chất trung gian làm tăng sự biểu lộ các receptor

có ái tính thấp với IL-2 Vì vậy nó gắn được ít IL-2 hơn các receptor có ái tính cao

Sự bổ xung IL-2 làm đẩy mạnh một số chức năng của tế bào lympho T trước khi xảy ra tăng sinh Ngoài việc chế tiết IL-2, các lympho T hoạt hóa còn sản xuất các lymphokin khác kể cả các IFNγ, BCDF (B cell Diffrention Factor).

* Chức năng của IL-2

- Tác dụng tự kích (autocrin): IL-2 được tiết ra từ tế bào Th hoạt hóa có tác

dụng gây tăng sinh và biết hóa ngay trên bản thân những tế bào này

- Hoạt hóa Tc, Th: Giống như một yếu tố phát triển nó hỗ trợ cho sự tăng

sinh và biệt hóa của những tế bào nào có receptor với IL-2

Lympho T có hai dưới nhóm Th và Tc Khi được kích thích bằng kháng nguyên đặc hiệu hoặc mitogen, số lượng thực tế của chúng tăng lên Sự kết hợp của IL-2 với receptor đặc hiệu của chúng gây tăng sinh và biệt hóa chức năng của những tế bào này Vì thế, IL-2 rất cần cho sự phát triển của Tc là tế bào đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống virus và chống ung thư Thêm nữa việc gắn IL-2 vào receptor trên không chỉ kích thích sự tăng sinh của tế bào này mà còn phóng thích thêm những lymphokin (cytokin) khác Đặc trưng của đáp ứng này được duy trì bởi tương tác của kháng nguyên và các receptor đặc hiệu trên bề mặt tế bào T đáp ứng

- Hoạt hóa tế bào B đã được hoạt hóa:

Lympho B sau tiếp xúc với PWM (Pokeweed mitogen) – một lectin thực vật gây phân bào đối với lympho B phụ thuộc T – cũng gây ra sự biểu lộ IL-2R Sự tăng sinh của tế bào B do PWM đòi hỏi sự có mặt của IL-2 do tế bào Th1 cung cấp Tuy nhiên các yếu tố khác như IL-4 cũng cần cho sự biến hóa của tế bào B thành tương bào sản xuất kháng thể

- Hoạt hóa tế bào NK:

Tế bào NK có thể diệt một số tế bào ung thư nuôi cấy và tế bào nhiễm virus invitro Tế bào NK ở người diệt tế bào K 562 và có thể đo được bởi việc đánh dấu

tế bào đích với 51Cr

Lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy ít nhất trong 1 giờ với IL-2 thì thấy khả năng diệt của tế bào NK tăng lên đáng kể Khi NK được xử lý với IL-2 sản xuất IFNγ làm tăng khả năng gây độc của tế bào này.

* Các ứng dụng của IL-2

Trên bệnh nhân ung thư, người ta ứng dụng đưa IL-2 vào trị liệu nhằm làm tăng cường hệ thống đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân chống ung thư, Việc nghiên cứu IL-2 và IL-2R như là một dấu ấn cho theo dõi hiệu quả trị liệu ung thư vẫn còn tương đối ít và các kết quả vẫn chưa thống nhất Sự tăng cao hàm lượng của IL-2 và IL-2R thường gặp ở một số bệnh máu ác tính (Waldmann TA 1986) và các rối loạn

tự miễn như lupus bản đỏ hệ thống, viêm đa khớp (Semanzato G et al 1988) Trong UTVMH, các tác giả Lai NK Et al (1991); Hsu M.M 1995; Tan GL (1993) nhận thấy sự thay đổi hàm lượng IL-2 trong huyết thanh bệnh nhân có liên quan đến tiên lượng bệnh IL-2R là dấu hiệu tốt cho sự theo dõi hiệu quả điều trị của bệnh nhân

Tóm lại, việc định lượng IL-2 trong huyết thanh và đặc biệt là trong dịch nổi nuôi cấy lympho bào bệnh nhân UTVMH nói riêng và ung thư nói chung giúp ta đánh giá hoạt động của hệ miễn dịch, đặc biệt là đáp ứng miễn dịch tế bào, qua đó đánh giá tiên lượng bệnh nhân

1.3.2.2 Yếu tố hoại tử u - Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα)

Vào đầu thế kỷ 20 William Coley một nhà ngoại khoa đã quan sát thấy rằng những bệnh nhân ung thư bị nhiễm một số loại vị khuẩn nhất định thì khối u của họ

có thể bị hoại tử Với hy vọng rằng đây có thể là cứu cánh cho các bệnh nhân ung thư, Coley đã tiến hành tiêm cho các bệnh nhân ung thư nước nổi phân lập từ nuôi cấy một số vi khuẩn khác nhau Những nước nổi nuôi cấy này được gọi là “độc tố Coley” gây ra được hoại tử chảy máu khối u nhưng lại có một số tác dụng không mong muốn do vậy mà không thể dùng chúng điều trị ung thư Nhiều thập kỷ sau người ta mới biết rằng thành phần hoạt động của độc tố Coley chính là một lipopolysaccharide (nội độc tố) của thành tế bào vi khuẩn Nội độc tố này tự nó không thể gây ra hoại tử khối u được nhưng thay vào đó nó kích thích đại thực bào

sản xuất và giải phóng vào huyết thanh một yếu tố gọi là yếu tố hoại tử u alpha (TNFα) Cytokin này có tác dụng gây độc trực tiếp đối với tế bào u mà không có tác dụng đối với các tế bào bình thường Cơ chế tác dụng gây độc đặc hiệu của TNFα

đối với khối u cho đến nay vẫn còn chưa hiểu hết [20]

TNFα không chỉ có tác dụng gây hoại tử khối u mà còn đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của một đáp ứng viêm hữu hiệu có tác dụng thanh lọc các tác nhân gây bệnh khác nhau xâm nhập vào cơ thể Cùng với IL-1, TNFα hoạt động trên rất nhiều các loại tế bào khác nhau bao gồm các tế bào T, tế bào B, bạch cầu đa nhân trung tính, các nguyên bào sợi, các tế bào nội mô, các tế bào tủy xương làm cho tế bào này chế tiết rất nhiều độc tố khác nhau cần thiết cho sự phát triển của một đáp ứng viêm hữu hiệu [33]

Tuy nhiên việc sản xuất TNFα là một con dao hai lưỡi, nó có thể dẫn tới những phản ứng có hại, đôi khi có thể gây tử vong Vào cuối những năm 1980 Cerami và cộng sự đã cố xác định xem tại sao khi bị nhiễm một số ký sinh trùng, vi khuẩn và khối u lại dẫn đến tình trạng dị hóa mạnh gây gây suy mòn và đôi khi có thể dẫn tới sốc và tử vong Các tác giả này đã phát hiện ra rằng có một yếu tố có nguồn gốc từ đại thực bào đã gây ra trạng thái suy mòn nói trên và họ gọi yếu tố này là yếu tố gây suy mòn Việc clon hóa các gene mã hóa yếu tố hoại tử u alpha và yếu tố gây suy mòn đã cho thấy rằng hai yếu tố này hóa ra lại là cũng một protein nay cùng được ký hiệu là TNFα [21]

* Sinh học phân tử TNFα

TNFα là một polypeptide có trọng lượng phân tử 17k Da, có oqr dạng dimer, trimer, hoặc pentamer tùy thuộc vào loại và phương tiện tách chiết Những nghiên cứu invitro đã chỉ ra rằng ở chuột, thỏ và người, polypeptide được sản xuất như một tiền hormone không hoạt động TNFα của người bao gồm 157 acid amin, ngược lại polypeptid của nó thêm 16 acid amin nữa Gen TNFα tru khú ở nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 6 gần vùng gen của lymphotoxin được gọi là TNFβ, và những gen mã hóa kháng nguyên hòa hợp tổ chức [34]

TNFα được sản xuất chủ yếu bởi đại thực bào sau đó đi vào máu rồi đến các

mô và cơ quan khác, TNFα còn được tổng hợp trong các tế bào giết tự nhiên (NK), các tế bào u hắc tố và một vài dòng tế bào ung thư mARN của TNFα cũng được người ta xác định trong bạch cầu hạt, các lympho bào B, T và các tế bào sừng Sự tổng hợp và bài tiết TNFα được kích thích chủ yếu bởi các độc tố vi khuẩn do hoạt hóa của các thụ thể CD14 và CD18 Ngày nay, người ta cũng xác định TNFα tiết ra từ

tế bào mô mỡ, từ các vi tế bào đệm, các tế bào sao và từ nội mạc mạch máu [38]

* Sinh học phân tử thụ thể TNFα

Giống như những cytokin khác, TNFα ảnh hưởng tới các tế bào đích qua trung gian những thụ thể đặc hiệu Cho đến nay người ta đã xác định được hai loại thụ thể là p75 và p55 Phản ứng của TNFα với những thụ thể này làm hoạt hóa protein kina hay tyrosin kinase và protein G sau đó chuyển giao kích thích này đến cấu trúc nhân Trong nhân tế bào có sự hoạt hóa hàng loạt những yếu tố sao mã đối với protein điều hòa và các enzyme cũng như tăng cường tổng hợp một số protein

κB Hoạt hóa TNF qua thụ thể TNFR1 dẫn đến hiện tượng chết tế bào theo chương trình, ngược lại nếu TNF hoạt hóa qua thụ thể TNFR2 lại có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh qua con đường NF-κB [35]

Thụ thể TNFR1 có mặt ở hầu hết các mô trong khi đó thụ thể TNFR2 được điều hòa chặt chẽ và kết hợp chủ yếu với hệ miễn dịch Thụ thể type 2 chỉ được hoạt hóa bởi TNF màng trong khi thụ thể type 1 được hoạt hóa bởi cả TNF màng và

TNF hòa tan [48].

1.3.3 Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch

Levamisole (phenyl emido thiazole hay 2,3,5,6 tetrahydro - 6 - phenyllimidazo (2,1) thiazo) là chất kích thích miễn dịch được phát hiện từ năm

1971 bởi Andricec J.M và cộng sự Khởi đầu levamisole được dùng làm thuốc chống giun sán, sau nhận thấy nó có tác dụng làm tăng các lympho bào T và có tác dụng phục hồi cân bằng hoạt động giữa lympho bào T hỗ trợ và lympho bào T ức chế vì vậy được sử dụng như chất điều biến miễn dịch [1], [43], [49]

Những nghiên cứu tiếp theo đã cho người ta thấy rằng phần sunfua trong công thức phân tử của chúng có liên quan tới tác dụng kịch thích miễn dịch Từ đó

là cơ sở để nghiên cứu cải tiến cấu tạo phân tử của các chất bằng tổng hợp hóa học

để nâng cao kết quả kích thích miễn dịch Các biệt dược NPT 16416; ADA 202 -

718 là các thiazol benzimidazole của levamisole đang được thử nghiệm [45]

Trên thực tế cũng như lâm sàng levamisole đã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng Đến nay levamisol vẫn là thuốc kích thích miễn dịch cổ điển mà các nghiên cứu đã làm sáng tỏ mọi vấn đề về cơ chế tác dụng, công thức hóa học, cấu trúc phân

tử Vì vậy, Levamisol được sử dụng trong thực nghiệm nuôi cấy tế bào lympho máu

ngoại vi in vitro của công trình này, với vai trò là chứng dương [47]

1.3.4 Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC

Cây TNHC Crinum latifolium L đã được nhân dân sử dụng để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung, ngoài ra còn được sự dụng để điều trị bệnh ung thư như ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và tuyến tiền liệt Trong những năm qua đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu ở trong và ngoài nước về cây thuốc quý này [14], [17], [27]

Yui và cộng sự đã chứng minh alkaloid lycorin, hoạt chất chính từ cây náng

có tên khoa học Crinum latifolium L có tác dụng kích thích tế bào lympho T trong ống nghiệm và trên sinh vật hoạt động phát triển Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc

Trâm, và cộng sự cũng đã chứng minh dịch chiết nước nóng từ lá cây TNHC Việt Nam (Crinum latifolium L.) có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp lên các tế bào TCD3, TCD4 in

vitro [40] Nguyễn Thị Ngọc Trâm, và cộng sự cũng đã tiến hành thử nghiệm gây

ung thư trên chuột cống trắng Wistar 50 – 55 ngày tuổi, bằng cách cấy dưới da chất hóa học gây ung thư 20-methylcholantrene và tiến hành thí nghiệm cho uống dịch chiết bằng nước nóng của lá cây TNHC và kéo dài đời sống của súc vật mang u (53 ngày/73 ngày) [15] Kết quả này cho thấy dịch chiết này đã làm chậm sự tăng trưởng khối u thực nghiệm Ở Ấn Độ, tác giả Ghosal khẳng định một số alkaloid từ TNHC như crinafolin, crinafolidin đã được thử nghiệm với tế bào ung thư và cho kết quả dương tính [26] Để chứng minh tác dụng của viên Crila, một loại thuốc được chiết xuất từ lá cây TNHC (đã được dung trên bệnh nhân u xơ tuyến tiền liệt

và u xơ tử cung) có hỗ trợ điều trị ung thư (tác dụng tăng cường miễn dịch trên thực nghiệm, khả năng chữa tình trạng suy tủy xương của bệnh phóng xạ cấp, bán cấp và

có thể loại bỏ được tác dụng phụ nặng nề của hóa trị liệu) hay không, Phan Thị Phi Phi và cộng sự trường Đại học Y Hà Nội đã sử dụng mô hình chiếu tia xạ bán cấp cho chuột nhắt để gây suy giảm dòng tế bào tủy và dòng tế bào lympho và tế bào diệt tự nhiên (NK-natural killers) rồi điều trị với viên Crila, sau đó đánh giá khả năng hồi phục dòng tế bào lympho T, tế bào NK (cả về số lượng và chức năng tiết hai cytokin chủ yếu của miễn dịch chống ung thư: IL-2 và TNFα), và khả năng hồi phục dòng tế bào tủy của những chuột bị chiếu tia gamma này [19]

Sự giảm sút nặng nề của dòng tủy và dòng lympho xảy ra ở chuột nhắt chiếu tia cấp, bán cấp là các biến đổi đã được các nhà nghiên cứu y học và thực hành lâm sàng khẳng định Kết quả thu được của Phan Thị Phi Phi phù hợp với các tác giả đã được công bố trước đây Khi nhận định bằng hình thái học, chủ yếu dựa vào kích thước tế bào thì không phát hiện được sự thay đổi của bạch cầu ái toan và nhất là bạch cầu diệt tự nhiên NK, nhưng khi sự nhận dạng được dựa trên dấu ấn miễn dịch (kháng nguyên CD16+/56+ của NK) rõ ràng, chính xác thì tia gamma đã làm NK giảm sút đặc biệt có ý nghĩa, cả trong máu ngoại vi và trong lách, với p đều dưới

0,001 [17].

Các tế bào NK được phát hiện vào những năm 1980, khi người ta thấy máu

có khả năng gây độc với virus, với các tế bào máu gốc và tế bào ung thư Dưới tác dụng của tế bào NK, các tế bào ung thư máu, myeloma, carcinoma, sarcoma, melanoma của người bị dung giải hay ức chế Các chuột Beige có hoạt tính NK kém, rất nhạy cảm với bệnh ung thư máu NK được chính thức xem như một quần thể chống ung thư mạnh của miễn dịch bẩm sinh không đặc hiệu vì không cần mẫn cảm trước với kháng nguyên Chuột chiếu tia, uống viên Crila làm số lượng NK khôi phục về trị số sinh học

Các tế bào TCD4, TCD8 là các quần thể gây độc với virus và với ung thư thông qua 2 cytokin quan trọng nhất là IL-2 và TNF-α hay là trực tiếp gây dung giải tế bào ung thư và tế bào nhiễm virus Liều tia xạ đã sử dụng trong thực nghiệm đã gây giảm có ý nghĩa đặc biệt toàn bộ các nhóm tế bào lympho, đặc biệt là dòng T và

NK Số lượng hai loại TCD8a (CD8α/α) và TCD8b (CD8α/β) đều giảm mạnh cả ở lách và máu ngoại vi TCD8b là quần thể chủ yếu, chiếm đa số các tế bào tuyến ức chín và và

tế bào T chín ở máu ngoại vi, được giới hạn trong MHC lớp 1, có thể đại diện cho

TCD8 chín và có chức năng

Tế bào TCD8 (hay chủ yếu là TCD8b) là tế bào gây độc đặc hiệu chính với tế bào ung thư Ở đây tia gamma không những gây giảm có ý nghĩa số lượng tế bào của những quần thể này mà chức năng của chúng cũng giảm mạnh, thể hiện bằng giảm IL-2 Do TNF-α có nhiều nguồn ngốc hơn (đại thực bào, tế bào Mast, tế bào lympho) nên hàm lượng nó vẫn duy trì được

Khi được điều trị bằng Crila, các quần thể tế bào lympho CD3, CD4, CD8a và

CD8b, kể cả NK ở máu ngoại vi và ở lách được hồi phục cả số lượng, tỷ lệ % và cả chức năng chế tiết IL-2 về gần trị số sinh học IL-2 có tác dụng làm tăng sinh và tăng biệt hóa tế bào lympho T, hoạt hóa Tc (T cytotoxic) và hoạt hóa đại thực bào,

có vai trò quan trọng trong miễn dịch chống ung thư

Hàm lượng TNF-α được sản xuất từ nhiều loại tế bào TNF-α có tác dụng

hoạt hóa các đại thực bào, bạch cầu hạt và các tế bào gây độc, tăng cường sự dính của bạch cầu với tế bào nội mạc, gây gầy mòn, sốt, cảm ứng sự tiết protein pha cấp, kích thích sự tạo mạch máu, tăng cường sản xuất các phần tử MHC lớp 1 Tác dụng của TNF-α vì thế có trên 1 phổ rộng hơn, trong đó có cả tác dụng gây độc tế bào ung thư, tăng các phần tử MHC lớp 1 cho tế bào Tc hoạt động, nhằm tiêu diệt các tế bào ung thư Khi dùng Crila để điều trị cho chuột chiếu tia thì các tế bào đều có xu hướng gây tăng chế tiết, đưa về trị số sinh học hay cao hơn của hai cytokin nghiên cứu là IL-2 và TNFα.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2012 đến tháng 12/2012

• Các mẫu máu bệnh nhân được thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội

• Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào, thu dịch nổi, chiết tách ARN và phân tích được tiến hành tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà nội

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Bệnh nhân

10 ml máu được lấy từ bệnh nhân UTVMH giai đoạn trước điều trị tia xạ, hóa chất nằm tại khoa xạ 1 và xạ 3, Bệnh viện K Hà Nội từ tháng 3/2012, tuổi từ 12 đến 78 tuổi

2.2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

* Tiêu chuẩn lâm sàng

Bệnh nhân mới, được chẩn đoán xác định là UTVMH dựa vào kết quả giải phẫu bệnh của mô sinh thiết lấy từ khối u vòm họng Các bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu này được xếp loại giai đoạn từ III đến IVB với T1-4N0-3M0 theo cách phân loại T.N.M và giai đoạn lâm sàng của Liên ban phân loại ung thư đầu, cổ Hoa

Kỳ (American Joint Committee on Canner – AJCC) năm 1997 cụ thể

 Giai đoạn II: gồm T1-2N0-1M0

 Giai đoạn III: gồm T1-2N2 hoặc T3N0-2M0

 Giai đoạn IVA: T4N0-2M0

 Giai đoạn IVB: T bất kỳ N3M0

* Tiêu chuẩn xét nghiệm

Thể mô bệnh học được lựa chọn là thể ung thư biểu mô không biệt hóa (UCNT) dựa trên kết quả của phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh, bệnh viện K Hà Nội

2.2.1.2 Các đối tượng không đưa vào nghiên cứu

• Các thể mô bệnh học khác ngoài ung thư biểu mô không biệt hóa

• Các bệnh nhân ở giai đoạn I, II và có di căn (M1) trước khi được điều trị tia xạ lần đầu (quá muộn nên bệnh nhân thường xin về nhà)

• Các bệnh nhân tái phát hoặc đến khám định kỳ

2.2.2 Người bình thường

10 ml máu được lấy từ người khỏe mạnh về lâm sàng, tuổi từ 20 đến 60 là cán bộ, sinh viên trường Đại học Y Hà Nội

2.2.3 Vật liệu nghiên cứu

• Thuốc viên nén Crilin T hàm lượng 250 mg/viên, được cung cấp bởi Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Công ty Thiên dược, Bình Dương, Việt nam

• ARN của tế bào dòng chuẩn CTLL-2 và L929 làm chứng cho mARN của IL-2 và TNFα trong kỹ thuật RT-PCR được cung cấp bởi phòng thí nghiệm của Khoa Vi sinh, Sinh học tế bào và Khối u, Viện Karolinska, Stockhkolm, Thụy điển

• Môi trường và dung dịch sử dụng

- Môi trường RPMI 1640, dạng lỏng có màu cam, trong, pH 7.4, bảo quản 12 tháng kể từ ngày sản xuất Môi trường RPMI dạng bột có thể

sử dụng trong vòng 36 tháng kể từ ngày sản xuất Cả hai dạng này đều bảo quản ở tủ mát 4 - 80C