Thử nghiệm tác dụng kích thích miễn dịch của pidotimod sản xuất tại việt nam trên động vật thí nghiệm

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Thử nghiệm tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod sản xuất tại Việt Nam trên động vật thí nghiệm” nhằm mục đích: Đánh giá được tác dụng của Pid

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ ĐIỂM

THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD SẢN

XUẤT TẠI VIỆT NAM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ ĐIỂM

THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD SẢN

ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Người hướng dẫn:

TS Nguyễn Văn Rư Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa Sinh

2 Bộ môn Dược Lực

HÀ NỘI – 2014

Tôi xin chân thành cảm ơn chị Đặng Thị Kim Khuyên – học viên cao học khóa

17 đã tạo điều kiện, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô, các kỹ thuật viên –

Bộ môn Hóa Sinh và bộ môn Dược Lực - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội – những người thầy đã dìu dắt tôi suốt 5 năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành khóa luận

Hà nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Điểm

MỤC LỤC

CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về sinh lý miễn dịch 2

1.1.1 Khái niệm về miễn dịch 2

1.1.2 Miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immunity) 2

1.1.3 Miễn dịch đặc hiệu (specific immunity) 2

1.1.4 Các cơ quan và tế bào tham gia quá trình ĐƯMD 2

1.1.5 Tổng quan về sinh lý bệnh suy giảm miễn dịch: 4

1.2 Chất kích thích miễn dịch và nguyên lý đánh giá tác dụng 6

1.2.1 Khái niệm 6

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất KTMD 6

1.2.3 Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất KTMD 6

1.3 Một số nghiên cứu về Pidotimod 7

1.3.1 Cấu trúc hóa học của Pidotimod 7

1.3.2 Dược động học của Pidotimod 8

1.3.3 Tác dụng dược lý của pidotimod 8

1.3.4 Độc tính và tương tác thuốc 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.2.1 Thuốc và hóa chất 15

2.2.2 Thiết bị 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 15

2.4 Thiết kế nghiên cứu 16

2.4.1 Chuẩn bị 16

2.4.2 Tiến hành thí nghiệm 17

2.4.3 Một số chỉ tiêu đánh giá trong thí nghiệm 18

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 20

3.1 Sự biến đổi trọng lượng chuột 20

3.2 Ảnh hưởng của Pidotimod lên trọng lượng lách tương đối 21

3.3 Ảnh hưởng của pidotimod lên trọng lượng tuyến ức tương đối 22

3.4 Ảnh hưởng của pidotimod lên số lượng bạch cầu 24

3.5 Ảnh hưởng của Pidotimod lên chức năng của ĐTB 25

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 27

4.1 Về thiết kế nghiên cứu 27

4.2 Về kết quả nghiên cứu 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

RCT Nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng

DANH MỤC BẢNG:

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, các bệnh liên quan đến virus, liên quan đến phân tử gây suy giảm khả năng miễn dịch của cơ thể như: HIV, ung thư, nhiễm trùng… ngày càng gia tăng Vậy làm thế nào để hạn chế sự phát triển của bệnh cũng như kéo dài sự sống của người bệnh là vấn đề luôn được xã hội quan tâm

Chất kích thích miễn dịch đã được đưa vào sử dụng như một biện pháp giúp con người chống đỡ với bệnh tật Các nhà khoa học đã tìm ra một số chất kích thích miễn dịch có ứng dụng cao như: BCG, bronchovaxom, lentinan, levamisol Pidotimod có cấu trúc giống dipeptid là một hóa dược có khả năng kích thích miễn dịch đã được tìm ra bởi hãng Poli Industria Chimica – Italia vào đầu những năm 90 của thập kỷ XX Nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng khẳng định pidotimod

có tác dụng tốt trên hệ miễn dịch Hiện nay, thuốc đã được đưa vào sản xuất, sử dụng ở nhiều nước trên thế giới với các biệt dược như adimod, imunorix, onaka, pigitil, polimod…

Ở Việt Nam, Trường Đại học Dược Hà Nội đã và đang nghiên cứu, tổng hợp pidotimod để làm nguyên liệu sản xuất thuốc Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu thử

hoạt tính của thuốc này trên hệ miễn dịch Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Thử

nghiệm tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod sản xuất tại Việt Nam trên động vật thí nghiệm” nhằm mục đích:

Đánh giá được tác dụng của Pidotimod sản xuất tại Việt Nam lên trọng lượng chuột, trọng lượng tương đối các tổ chức lympho (lách, ức) và số lượng bạch cầu

ngoại vi và chức năng đại thực bào hệ lưới nội mô

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về sinh lý miễn dịch

1.1.1 Khái niệm về miễn dịch

Miễn dịch (immunity) là khả năng của cơ thể nhận biết, đáp ứng và loại bỏ các yếu tố lạ gây hại

Khi bị yếu tố gây bệnh (kháng nguyên) xâm nhập, trước tiên cơ thể vận hành ngay một số tế bào và phân tử sẵn có để kịp thời ngăn chặn, xử lý, sau đó tạo ra các

tế bào và phân tử đặc hiệu tương ứng với từng loại kháng nguyên khác nhau để loại trừ chúng

Phân loại ĐƯMD: gồm 2 loại

- ĐƯMD tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu)

- ĐƯMD thu được (miễn dịch đặc hiệu) [3], [5]

1.1.2 Miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immunity)

Được hình thành trong quá trình tiến hóa của của động vật để chống lại sự xâm nhập, gây nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh Miễn dịch không đặc hiệu không để lại trí nhớ, khá ổn định và ít bị sai sót

Các mô, tế bào, phân tử tham gia vào ĐƯMD không đặc hiệu gồm: da, niêm mạc, các tế bào thực bào, hệ thống bổ thể, IFN, … [5]

1.1.3 Miễn dịch đặc hiệu (specific immunity)

Là trạng thái miễn dịch xuất hiện do kháng thể đặc hiệu tương ứng với từng kháng nguyên được tạo ra sau khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên (ngẫu nhiên hoặc chủ động) Miễn dịch đặc hiệu có khả năng nhận dạng được hầu hết kháng nguyên và để lại trí nhớ miễn dịch

Miễn dịch đặc hiệu gồm miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào với sự đảm nhiệm của các tế bào lympho B và lympho T [5]

1.1.4 Các cơ quan và tế bào tham gia quá trình ĐƯMD

1.1.4.1 Cơ quan lympho trung ương

Là nơi sinh sản và biệt hóa tế bào lympho đến trưởng thành, đủ khả năng xử

lý kháng nguyên

Tủy xương: Là cơ quan trung ương của mọi tế bào máu, nhạy cảm với tia xạ

và các thuốc chống phân bào

Tuyến ức: Đảm nhiệm chức năng huấn luyện, phân chia, biệt hóa, các tế bào

lympho T là nhờ một số yếu tố hòa tan (thymulin, thymosin α1, …) [5]

1.1.4.2 Cơ quan lymopho ngoại vi

Là nơi tế bào lympho trú ngụ và biệt hóa dưới tác động của kháng nguyên

Hạch lympho: Được coi như một cái lọc đối với các phân tử lạ ngoại lai và các

mảnh vụn từ mô hoại tử, là trung tâm của sự tuần hoàn các tế bào lympho, nơi tế bào tiếp xúc với kháng nguyên

Lách: có nhiệm vụ lọc và dự trữ máu cho cơ thể, ngoài ra còn là nơi tập trung

kháng của kháng nguyên vào cơ thể bằng đường máu

Các mô lympho không có vỏ bọc: nằm rải rác ở niêm mạc đường tiêu hóa, hô

hấp, tiết niệu,… [5]

1.1.4.3 Các tế bào tham gia quá trình ĐƯMD

Lympho bào: chiếm khoảng 20 - 30 % tổng số bạch cầu trong máu, có vai trò

chủ chốt trong miễn dịch đặc hiệu Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, sẽ gặp phải hàng loạt cơ chế bảo vệ tự nhiên không đặc hiệu nhằm tiêu diệt hoặc loại trừ chúng ra khỏi cơ thể Nếu kháng nguyên vượt qua được hàng rào này, và có đủ thời gian, chúng sẽ gặp phải các chất bảo vệ đặc hiệu trong ĐƯMD đặc hiệu ĐƯMD đặc hiệu xuất hiện sẽ làm ĐƯMD tự nhiên được tăng cường [5]

Tế bào diệt tự nhiên NK (natural killer): Là một tiểu quần thể tế bào giống

lympho, có khả năng diệt một số tế bào đích: tế bào u, tế bào vật chủ nhiễm virus Chức năng quan trọng của NK là kiểm soát miễn dịch, ngăn chặn sự di cư của tế bào u qua máu, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm virus Các tế bào NK có thể hạn chế hoặc làm trầm trọng hơn các phản ứng miễn dịch [6], [26], [29]

Tế bào thực bào đơn nhân (monocyte): đóng vai trò phòng thủ do khả năng

thực bào các loại ký sinh trùng và vi khuẩn Các ĐTB còn có vai trò quan trọng trong sự khởi động quá trình miễn dịch đặc hiệu, chúng cần thiết cho việc hoạt hóa các tế bào lympho T và lympho B trước sự xâm nhập của các kháng nguyên ngoại

lai Bên cạnh đó, ĐTB còn tiết ra các chất cytokin như IL-1, IL-6, TNF-α khởi phát quá trình viêm không đặc hiệu [6], [11], [18], [19], [27]

Các tế bào máu khác: Bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ái kiềm và

dưỡng bào (mastocyte), Bạch cầu ái toan đều có vai trò quan trọng trong ĐƯMD của cơ thể với kháng nguyên

1.1.5 Tổng quan về sinh lý bệnh suy giảm miễn dịch:

Suy giảm miễn dịch là tình trạng của cơ thể sống trong đó hệ thống miễn dịch hoạt động yếu, không đáp ứng được với yêu cầu của cuộc sống bình thường, dẫn đến không chống lại được với các vi sinh vật gây bệnh mà hậu quả là cơ thể bị nhiễm trùng nặng đi đến tử vong hay nói cách khác là sinh ra rất ít kháng thể đặc hiệu trong khi cơ thể khác lại sinh miễn dịch khi đặt trong cùng điều kiện

Suy giảm miễn dịch đƣợc chia làm hai loại:

Suy giảm miễn dịch bẩm sinh

Suy giảm miễn dịch bẩm sinh hay tiên phát là do những bất thường mang tính

di truyền, tạo ra những khuyết tật trong hệ thống miễn dịch, có thể là:

+ Suy giảm miễn dịch ngay từ tế bào gốc chung cho cả hai dòng lympho bào

B và T

+ Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng T: có 2 trường hợp: suy giảm nặng dòng

T do sự suy giảm hoạt động của tuyến ức làm cho dòng lympho bào T không trưởng thành và biệt hoá được, do đó không có miễn dịch qua trung gian tế bào Hiện tượng này gọi là hội chứng George Trường hợp thứ hai là rối loạn quá trình hoạt hoá của lympho bào T trưởng thành

+ Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng B: có thể là do tổn thương tuỷ xương mà không có biệt hoá dòng lympho bào B hoặc có thể có sai sót trong quá trình hoạt hoá của lympho bào B trưởng thành dẫn đến rối loạn sự tổng hợp các kháng thể dịch thể

+ Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng các tế bào thực bào và sản xuất bổ thể gây giảm tế bào thực bào và thiếu hụt bổ thể

Suy giảm miễn dịch mắc phải

Suy giảm miễn dịch mắc phải là một trạng thái bệnh lý rất hay gặp, là một hiện tượng thứ phát sau nhiều bệnh Nhất là các bệnh gây suy dinh dưỡng, nhiễm độc, ảnh hưởng của một số thuốc gây ức chế miễn dịch và do kết quả của các bệnh truyền nhiễm như ở người là nhiễm virus HIV - một bệnh nan y của thời đại

• Suy giảm miễn dịch thứ phát do suy dinh dưỡng

Người ta đã thấy rõ rằng khi cơ thể bị suy dinh dưỡng sẽ xuất hiện trạng thái suy giảm miễn dịch cả không đặc hiệu lẫn đặc hiệu mà cơ chế bệnh sinh ra là do thiếu nguyên liệu trong sinh tổng hợp các chất, đặc biệt là thiếu đạm

• Suy giảm miễn dịch thứ phát do nhiễm trùng

Trong tất cả các trường hợp nhiễm khuẩn (virus, vi khuẩn, nấm hay ký sinh trùng) Nếu kéo dài sẽ gây suy dinh dưỡng dẫn đến suy giảm miễn dịch Nhiễm virus dẫn đến rối loạn đáp ứng miễn dịch và làm suy giảm miễn dịch dễ dẫn đến các bội nhiễm các bệnh khác

Nhiễm khuẩn mãn tính, đặc biệt là nhiễm vi khuẩn nội bào như bệnh hủi, lao thì bao giờ cũng gây ra suy giảm miễn dịch tế bào

Ở người, trong căn bệnh thế kỷ AIDS do nhiễm bởi loại Retrovirus HIV-I và HIV-II, chúng có ái tính đặc biệt với phân tử CD4 và Receptor với một số chemokin

có trên các tế bào có thẩm quyền miễn dịch mà chủ yếu là các lympho bào Th và đại thực bào Virus làm ly giải các tế bào TCD4 hoặc bất hoạt chúng, số lượng tế bào

TCD4 suy giảm trầm trọng ở người nhiễm HIV (bình thường tỷ lệ TCD4/TCD8 là 2/1, khi nhiễm HIV thì có thể chỉ là 0,5/1)

Từ giảm sút Th dẫn đến suy giảm miễn dịch trầm trọng

• Suy giảm miễn dịch thứ phát do một số bệnh khác

Các bệnh ác tính như ung thư, bệnh máu ác tính và các bệnh về thận như suy thận, thận nhiễm mỡ đều dẫn đến suy giảm miễn dịch

Ngoài ra ở các cơ thể già, do có những thay đổi trong hoạt động miễn dịch, người ta thấy có những suy giảm miễn dịch rõ rệt, do đó ở người già thường thấy tăng khả năng nhiễm khuẩn, hay bị ung thư, mắc bệnh tự miễn (thấp khớp) , chính

là do sự suy giảm miễn dịch [5]

Như vậy, ĐƯMD là một quá trình phức tạp xảy ra khi có sự tiếp xúc của

kháng nguyên ngoại lai và hệ miễn dịch Điều hòa hoạt động của hệ miễn dịch, giữ cân bằng nội môi cần có sự tham gia và phối hợp của nhiều cơ quan, tổ chức và tế bào sẽ giúp cho cơ thể chống lại các kháng khuyên gây bệnh

1.2 Chất kích thích miễn dịch và nguyên lý đánh giá tác dụng

1.2.1 Khái niệm

Các chất KTMD là những chất đưa vào cơ thể nhằm biến đổi khả năng của các

tế bào đáp ứng với kháng nguyên hoặc làm thay đổi sự tương tác giữa các tế bào

hay giữa các chất trung gian cần thiết cho sự tạo nên một ĐƯMD [3], [6]

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất KTMD

Chủ yếu theo 2 cơ chế:

- Tác động vào quá trình biến đổi, chuyển hóa của các kháng nguyên như tăng tích lũy kháng nguyên, giảm đào thải kháng nguyên, do đó kéo dài sự có mặt của kháng nguyên trong cơ thể và gây ra kích thích liên tục giống như tiêm kháng nguyên liều nhỏ nhưng nhiều lần và kéo dài

- Tương tác với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch: làm tăng hiện tượng thực bào, tăng hoạt hóa ĐTB, tăng sự tiếp xúc và hòa màng giữa ĐTB và tế bào lympho để truyền thông tin kháng nguyên từ ĐTB sang tế bào lympho sản xuất kháng thể quyết định tính đặc hiệu của kháng thể đối với kháng nguyên [3]

1.2.3 Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất KTMD

Chất KTMD tác động vào nhiều khâu trong quá trình miễn dịch Vì vậy, các

kỹ thuật đánh giá tác dụng của các chất KTMD rất đa dạng và có thể thực hiện theo các khâu chính sau đây:

Khâu xử lý kháng nguyên thông qua hoạt động của ĐTB:

- Kỹ thuật ức chế di tản ĐTB

- Kỹ thuật điện di ĐTB

- Kỹ thuật ức chế dính bạch cầu

- Kỹ thuật ức chế trải giăng bạch cầu

- Đo hoạt tính thực bào và đánh giá khả năng tiêu hóa nội tế bào của ĐTB

Có thể đánh giá chức năng của ĐTB trong giai đoạn cảm ứng miễn dịch bằng cách xác định tỷ lệ % các ĐTB có ăn kháng nguyên và số lượng kháng nguyên bị vây bắt ở mỗi ĐTB (chỉ số thực bào) [3]

Khâu hiệu ứng của đáp ứng miễn dịch: lympho bào T

- Thử nghiệm chuyển dạng lympho bào: dựa vào đặc tính của lympho T, khi

có mặt của kháng nguyên đặc hiệu, các lympho bào mẫn cảm phản ứng bằng cách chuyển sang dạng “blast” (tế bào lớn, bào tương phình to, hạt nhân nổi rõ)

- Thử nghiệm tạo hoa hồng tự nhiên E (Rosette E): dựa trên khả năng tạo hoa hồng với hồng cầu cừu của lympho T

- Thử nghiệm tạo hoa hồng kép: thường kết hợp đồng thời thử nghiệm tạo hoa hồng E với thí nghiệm tạo hoa hồng EA (hồng cầu gà E được bao phủ bởi kháng thể kháng hồng cầu gà A để tạo phức hợp EA) [3]

Khâu đáp ứng miễn dịch của lympho bào B và kháng thể Ig

- Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch

- Kỹ thuật tạo hoa hồng EAC: dùng để phát hiện lympho B mang thụ thể dành cho bổ thể, sử dụng hồng cầu cừu E được bao phủ bởi hémolysin – kháng thể IgM (A) và bổ thể (C) thành phức hợp EAC

- Kỹ thuật Jerne: phát hiện lympho bào B tiết kháng thể Thực hiện trên môi trường thạch hoặc môi trường lỏng, dựa trên nguyên lý tạo quầng dung huyết khi cho tế bào lympho tiếp xúc với hồng cầu cừu đồng thời với sự có mặt của bổ thể

- Đánh giá tương đối lượng kháng thể bằng cách xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh dựa trên phản ứng ngưng kết hồng cầu [3]

Như vậy, đối với một chất KTMD, có khá nhiều phương pháp để đánh giá tác

dụng trên hệ miễn dịch Tùy vào điều kiện thực tế cũng như đối tượng, mục tiêu cần đánh giá để lựa chọn phương pháp tối ưu mang lại hiệu quả cao

1.3 Một số nghiên cứu về Pidotimod

1.3.1 Cấu trúc hóa học của Pidotimod

 Danh pháp

- Tên INN: Pidotimod

- Tên khoa học: acid thiazolidine-4-carboxylic

(R)-3-[(S)-(5-oxo-2-pyrrolidinyl)carbonyl] Mã ATC: L03AX05 [16], [19], [29]

 Công thức hóa học

- Công thức phân tử: C9H12N2O4S

- Khối lượng phân tử: 244,26 g/mol

- Công thức cấu tạo: [16], [19]

 Tính chất lý hóa

- Bột tinh thể không mùi, màu trắng hoặc trắng ngà

- Điểm chảy 194oC–198oC, sự chảy kèm theo phân hủy nhanh chóng

- Năng suất quay cực [α]25D: 150o

- Độ tan của Pidotimod trong nước là 37,8 (g/l) [16]

1.3.2 Dƣợc động học của Pidotimod

Trên động vật (chuột, chó): Pidotimod hấp thu nhanh qua đường uống, tốc độ

thải trừ nhanh (T1/2 = 1 giờ), thể tích phân bố lớn, thuốc phân bố nhanh vào các cơ quan chính, đặc biệt là gan và thận Sự bài tiết qua nước tiểu ở dạng không chuyển đổi là 75,6% sau tiêm tĩnh mạch và 31,1% sau uống Sinh khả dụng của thuốc là 100% qua đường tiêm bắp và 27% qua đường uống [13]

Trên người: Thuốc hấp thu nhanh qua đường uống và sinh khả dụng là 40 –

44%, T1/2 = 4 giờ, không phụ thuộc liều và đường dùng; thuốc không bị chuyển hóa

và thải trừ hầu hết ở dạng chưa chưa chuyển hóa ra ngoài nước tiểu; thể tích phân

bố lớn (khoảng 30 lít) [22]

1.3.3 Tác dụng dƣợc lý của pidotimod

Nhiều nghiên cứu trong ống nghiệm, trên động vật thí nghiệm và trên người trước đây cho thấy pidotimod có tác dụng dược lý trên hệ miễn dịch rất rõ ràng, tác

động trên nhiều tế bào, nhiều khâu của quá trình miễn dịch Trong khuôn khổ của bài khóa luận, chúng tôi chỉ trình bày một cách ngắn gọn một số kết quả của các nghiên cứu về các tác dụng của Pidotimod để đưa ra cái nhìn tổng quan nhất về tác dụng của chất điều biến miễn dịch này

1.3.3.1 Các nghiên cứu trên động vật

 Tác động lên ĐTB

Các thí nghiệm trên chuột bị ức chế miễn dịch chứng tỏ pidotimod có tác động tích cực lên chức năng của ĐTB (khả năng hóa ứng động, khả năng sản xuất gốc độc, sản sinh các cytokin gây viêm) [12], [27], [28]

- Pidotimod làm tăng tính hóa ứng động của ĐTB: Prednisolon làm giảm

khả năng hóa ứng động của các ĐTB xuống còn ¼ so với nhóm chứng (không bị ức chế miễn dịch, p < 0.001), nhưng khi điều trị với pidotimod, khả năng hóa ứng động của ĐTB đã được tăng cường một cách rõ rệt và phục hồi gần như hoàn toàn so với nhóm chứng (kể cả đường uống và tiêm phúc mạc) [12], [28]

- Pidotimod kích thích ĐTB tăng cường sản xuất các gốc độc: Sử dụng

prednisolon gây suy giảm miễn dịch làm giảm đáng kể quá trình sản xuất các gốc độc của ĐTB khi được ủ với các tác nhân thích hợp (anion superoxid, p < 0,01; NO,

p < 0,001) Và khi điều trị cùng với pidotimod thì sự ức chế này gần như bị loại bỏ, đưa lượng NO, superoxid trở về mức ban đầu [12], [28]

- Pidotimod kích thích ĐTB sản sinh ra các cytokine gây viêm: Khi được

hoạt hóa, các ĐTB cũng có thể tạo ra những cytokin gây viêm như TNF-α, IL-1 và IL-6 Nghiên cứu trên chuột bị ức chế miễn dịch bởi prednisolon và được kích thích

bởi các yếu tố gây viêm như LPS, bào tử nấm Aspergilus fumigatus sự sản sinh

TNF-α thấp hơn đáng kể so với nhóm chứng (không bị ức chế, p < 0,05) nhưng khi được điều trị bằng pidotimod thì lượng TNF-α được hồi phục và thậm trí còn tăng

so với nhóm chứng (p < 0,001) [13], [28]

 Tác động lên tế bào NK

Nghiên cứu trên tế bào NK lách chuột ở các tuần tuổi khác nhau (10 tuần và

30 tuần) được ủ với tế bào YAC-1 có gắn đồng vị phóng xạ 51Cr cho thấy,

pidotimod liều cao (200mg/kg) tăng cường hoạt động của tế bào NK (không phân biệt so với chứng), liều thấp hơn thay đổi không đáng kể, thậm chí còn gây ức chế (liều 50 mg/kg) Kết quả này cho thấy pidotimod có khả năng điều biến hoạt động của NK [26]

 Tác động lên tế bào lympho

- Trên miễn dịch qua trung gian tế bào: Nghiên cứu các phản ứng tạo hoa

hồng với hồng cầu cừu, phản ứng tăng sinh đáp ứng với các mitogen (Con – A, LPS), phản ứng quá mẫn muộn với DNCB hay phản ứng chống thải ghép ở chuột bị gây suy giảm miễn dịch và được điều trị bằng pidotimod đều tăng lên có ý nghĩa thống kê so với nhóm không được điều trị Các kết quả đều thể hiện pidotimod có khả năng phục hồi các chức năng của hệ miễn dịch qua trung gian tế bào trở về mức

bình thường [12], [27]

- Trên miễn dịch dịch thể: Đánh giá ĐƯMD dịch thể của pidotimod, người

ta sử dụng hai phản ứng với hai kháng nguyên khác nhau (LPS – đối với miễn dịch thể không phụ thuộc tuyến ức; hồng cầu cừu 3% - đối với miễn dịch dịch thể phụ thuộc tuyến ức) trên chuột đã có ĐƯMD với các kháng nguyên này để đo hiệu giá kháng thể Dựa vào các kết quả này, có thể nói rằng, pidotimod có tác dụng làm tăng cường ĐƯMD với các kháng nguyên này, đưa hiệu giá kháng thể trở về mức

bình thường [12], [27]

 Tác dụng chống lại vi sinh vật

ĐƯMD chống vi sinh vật là chức năng quan trọng và cần thiết để bảo vệ cơ thể chống lại các vi sinh vật gây bệnh Các nghiên cứu trên chuột cho thấy, pidotimod có tác dụng bảo vệ, làm tăng tỷ lệ sống của con vật trước tình trạng nhiễm vi khuẩn hoặc virus

- Tác dụng chống vi khuẩn: Để nghiên cứu khả năng chống lại vi khuẩn

của pidotimod, đã có nhiều mô hình thực nghiệm khác nhau được thiết lập Trong

đó có 5 mô hình nhằm: xác định liệu trình điều trị với pidotimod cho hiệu quả thấp nhất; đánh giá hiệu lực tác dụng của thuốc trên nhiều chủng vi khuẩn; so sánh hiệu lực của pidotimod với những thuốc được chọn làm chuẩn; đánh giá tác dụng của

thuốc trên chuột bị gây ức chế miễn dịch; nghiên cứu hiệu lực của thuốc khi kết hợp với các kháng sinh β-lactam [14]

Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng, dù cho không có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng candida ở điều kiện in vitro, nhưng pidotimod thực sự có khả năng kích thích cơ chế miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể với hiệu quả cao, tác dụng của pidotimod là rõ rệt và có ý nghĩa thống kê cao sau 5 lần sử dụng trước tình trạng nhiễm khuẩn Pidotimod chống lại sự lây nhiễm của nhiều chủng vi khuẩn với mức liều 0,01 – 100 mg/kg i.p × 5 lần Pidotimod có tác dụng tương đương hoặc tốt hơn

so với các thuốc chuẩn so sánh như bestatin,

N-acetylmuramyl-L-Ala-D-iso-Glu-OH và tuftsin; thể hiện rõ tác dụng bảo vệ trên chuột đã được gây ức chế miễn dịch, cũng như giúp tăng cường tác dụng kháng khuẩn in vivo của các kháng sinh cefotaxim và ampicillin, theo hướng hỗ trợ hoặc hiệp đồng (kháng sinh diệt vi khuẩn trực tiếp và pidotimod tác động lên hệ miễn dịch làm tăng khả năng tiêu diệt

vi khuẩn của cơ thể) [14], [27]

- Tác dụng chống virus: Các thí nghiệm đã tiến hành với 3 loại virus và 2

mức liều (virus) gây nhiễm khác nhau: virus viêm màng não (Mengovirus), virus Herpes simplex (HSV), và virus cúm A chủng PR – 8 Pidotimod được dùng 15 ngày trước khi gây nhiễm và trong suốt quá trình chuột bị nhiễm virus cho tới khi chết Tác dụng của thuốc thể hiện ở tỷ lệ sống sót khác nhau giữa lô chỉ nhiễm virus (lô chứng) và lô nhiễm virus nhưng được điều trị bằng pidotimod (lô thử) Thời gian

mà một nửa số chuột bị chết ở lô chứng và lô thử: với Mengovirus tương ứng là 3

và 5,5 ngày; với HSV tương ứng là 3 và 5 ngày; với virus cúm A PR – 8 là 3 và 6,5 ngày Thời gian mà tất cả chuột chết ở lô chứng là 7 ngày còn ở lô thử là 8 ngày [17]

Pidotimod không phải là thuốc chống virus đặc hiệu Các dữ liệu nghiên cứu toàn cầu chỉ ra rằng, tác dụng của pidotimod không phụ thuộc vào loại virus và không liên quan chặt chẽ đến cơ chế nhân lên của mỗi loại virus [17], [27]

 Các tác dụng khác

Ngoài tác dụng trên hệ miễn dịch, Pidotimod đã được đánh giá khả năng tác dụng lên các cơ quan khác ở động vật thí nghiệm

Trên hệ thần kinh

- Pidotimod không có tác động lên hệ thần kinh[24]

Trên hệ tim mạch

- Cơ bản pidotimod không ảnh hưởng lên sự hoạt động bình thường của tim

và huyết áp; không thể hiện tác dụng chống tăng huyết áp hay chống loạn nhịp trên chuột thí nghiệm [24]

Trên hệ tiết niệu

Các thông số về thể tích nước tiểu và nồng độ ion niệu không có sự sai khác với bình thường ở chuột được cho dùng pidotimod liều 100 và 200 mg/kg i.p và 200 mg/kg p.o Duy chỉ có ở liều 400 mg/kg p.o nồng độ ion Na+ và K+ có tăng hơn so với trị số bình thường [24]

Các khảo sát khác

Pidotimod không có tác dụng chống viêm, không gây hạ glucose máu, không gây tê tại chỗ, không ảnh hưởng tới kết tập tiểu cầu hay sự đáp ứng của ruột cô lập thử với histamin, acetylcholin và BaCl2 [24]

1.3.3.2 Các nghiên cứu trên người

Các nghiên cứu trên người nhằm mục đích: xác nhận các kết quả thu được ở động vật và kiểm tra các tác động trên hệ miễn dịch của pidotimod với đối với các quần thể bệnh nhân có tình trạng suy giảm miễn dịch khác nhau

- Nghiên cứu trên các bệnh nhân bị ung thư, và bệnh nhân bị khối u (mới và

di căn) cho thấy bổ sung Pidotimod làm tăng đáp ứng với các mitogen (con – A, PHA) và sự tăng tiết IL – 2 của các tế bào đơn nhân vùng ngoại vi và của các tế bào lympho T ở nhóm bệnh nhân này

- Nghiên cứu trên nhóm bệnh nhân lớn tuổi (đặc trưng là suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào): pidotimod kích thích ĐTB phúc mạc tăng tiết cytokine IFN-γ và giảm tiết IL-6 so với trước khi sử dụng và so với nhóm chứng sử dụng giả

dược Pidotimod cũng kích thích tế bào lympho T tăng tiết IL-2 và tăng đáp ứng với PHA đáng kể so với nhóm giả dược [27]

- Trên đối tượng là trẻ em bị nhiễm trùng đường hô hấp, pidotimod làm giảm đáng kể tất cả các thông số thời gian sốt, điều trị kháng sinh, tỷ lệ tái phát [26] Nghiên cứu RCT trên 120 bệnh nhân nhi bị nhiễm trùng hô hấp tái phát cho thấy, pidotimod đã làm giảm 35% nguy cơ tái phát, giảm thời gian nhập viện (86%)

và giảm điều trị kháng sinh (47%); p < 0,01 Nếu tái phát có xảy ra ở những bệnh nhân này, các triệu chứng của bệnh nhân cũng giảm nhanh hơn[9]

- Nghiên cứu RCT trên 60 bệnh nhân nhi bị nhiễm trùng tiết niệu tái phát cho thấy, so với giả dược, những bệnh nhân sử dụng pidotimod có thời gian phục hồi nhanh hơn (9,6 so với 12,3 ngày); thời gian điều trị kháng sinh ngắn hơn (6,9 so với 8,3 ngày); và một số triệu chứng chính (sốt, bí tiểu, tiểu nhiều lần, tiểu ra máu…) giảm nhanh hơn [11]

- Trên bệnh nhân bị viêm amidal cấp tính: pidotimod làm giảm đáng kể tần

số các bệnh nhiễm trùng cũng như cải thiện các dấu hiệu lâm sàng (ho, khó nuốt) và thời gian điều trị kháng sinh

- Trên nhóm bệnh nhân Down bị nhiễm trùng đường hô hấp: pidotimod làm giảm đáng kể tần số, mức độ nghiêm trọng và thời gian truyền nhiễm so với nhóm chứng không được điều trị [27]

1.3.4 Độc tính và tương tác thuốc

Tương tác thuốc: Pidotimod không làm thay đổi nồng độ và tác dụng của các

thuốc dùng cùng Pidotimod khá an toàn khi điều trị cùng với các thuốc khác [24]

Độc tính: Nghiên cứu độc tính của Pidotimod trên chuột nhắt, chuột cống,

chó, cho thấy pidotimod khá an toàn, độc tính thấp

- Độc tính cấp thể hiện ở liều rất cao: Đối với cả 2 loại chuột: > 8000 mg/kg (p.o và i.p.), > 4000 mg/kg (i.v và i.m) Ở chó, liều độc > 4000 mg/kg (p.o.), >

2000 mg/kg (i.v và i.m)

- Độc tính mạn: theo dõi ở chuột trong vòng 4 tháng (với i.v.) và 12 tháng (với p.o.), pidotimod không thể hiện độc tính ở liều 200 mg/kg (i.v.) và liều 800

mg/kg (p.o.), liều này cao gấp 32,5 lần liều sử dụng trên lâm sàng Tương tự, theo dõi độc tính trên chó 26 tuần với tiêm bắp và 52 tuần với đường uống, pidotimod không gây độc ở liều 300 mg/kg (i.m.) và liều 600 mg/kg (p.o.), các liều này cao hơn liều sử dụng trên lâm sàng lần lượt là 48,8 và 24,4 lần

- Pidotimod không ảnh hưởng lên chức năng sinh sản ở cả chuột cái và chuột đực ở liều 600 mg/kg (p.o.) và 500 mg/kg (i.v.)

- Pidotimod không gây quái thai ở chuột (1000 mg/kg i.v và 600 mg/kg p.o.), ở thỏ (300 mg/kg p.o và 500 mg/kg i.v.)

- Chỉ số điều trị ở chuột dao động trong khoảng 40 – 80 [15]

Như vậy, các khảo sát cho thấy pidotimod khá an toàn, ngoài tác dụng trên hệ

thống miễn dịch thì sự tác động tới các hoạt động chức năng khác là không có hoặc không rõ ràng Tính đơn nhất trong tác động của Pidotimod (chỉ trên hệ miễn dịch)

là một thuộc tính có lợi trong điều trị, do đó hạn chế được những tác dụng phụ

không mong muốn

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, khỏe mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp, khối lượng trung bình 20 ± 2 g

Tất cả động vật trên sau khi mua về được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn, nước uống, độ ẩm, và ánh sáng tại khu nghiên cứu động vật thực nghiệm của Bộ môn Dược Lực, trường Đại học Dược Hà Nội Chuột được nuôi một tuần trước khi tiến hành thử nghiệm để làm quen với môi trường Khi tiến hành thí nghiệm chuột đạt khối lượng 30 – 35 g

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.2.1 Thuốc và hóa chất

- Pidotimod do bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược cung cấp

- Cyclophosphamid (biệt dược endoxan)

- Mực pelikan – 4001 (Đức)

- HCl 0.1N

- Nước muối sinh lý 0,9%

2.2.2 Thiết bị

- Bơm, kim tiêm, mao quản, panh, kéo, bàn mổ

- Cân kỹ thuật, cân phân tích