Thử nghiệm tác dụng kích thích miễn dịch của pidotimod sản xuất tại việt nam trên động vật thí nghiệm

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ ĐIỂM THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ ĐIỂM THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD SẢN XUẤT TẠI VIỆT NA M TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Văn Rƣ Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa Sinh. 2. Bộ môn Dược Lực. HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới người thầy: TS. Nguyễn Văn Rư – trưởng Bộ môn Hóa Sinh – trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn chị Đặng Thị Kim Khuyên – học viên cao học khóa 17 đã tạo điều kiện, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô, các kỹ thuật viên – Bộ môn Hóa Sinh và bộ môn Dược Lực - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội – những người thầy đã dìu dắt tôi suốt 5 năm học vừa qua. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành khóa luận. Hà nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Lê Thị Điểm MỤC LỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về sinh lý miễn dịch 2 1.1.1. Khái niệm về miễn dịch 2 1.1.2. Miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immunity) 2 1.1.3. Miễn dịch đặc hiệu (specific immunity) 2 1.1.4. Các cơ quan và tế bào tham gia quá trình ĐƯMD 2 1.1.5. Tổng quan về sinh lý bệnh suy giảm miễn dịch: 4 1.2. Chất kích thích miễn dịch và nguyên lý đánh giá tác dụng 6 1.2.1. Khái niệm 6 1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất KTMD 6 1.2.3. Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất KTMD 6 1.3. Một số nghiên cứu về Pidotimod 7 1.3.1. Cấu trúc hóa học của Pidotimod 7 1.3.2. Dược động học của Pidotimod 8 1.3.3. Tác dụng dược lý của pidotimod 8 1.3.4. Độc tính và tương tác thuốc 13 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.2.1. Thuốc và hóa chất 15 2.2.2. Thiết bị 15 2.3. Nội dung nghiên cứu 15 2.4. Thiết kế nghiên cứu 16 2.4.1. Chuẩn bị 16 2.4.2. Tiến hành thí nghiệm 17 2.4.3. Một số chỉ tiêu đánh giá trong thí nghiệm 18 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ 20 3.1. Sự biến đổi trọng lượng chuột 20 3.2. Ảnh hưởng của Pidotimod lên trọng lượng lách tương đối 21 3.3. Ảnh hưởng của pidotimod lên trọng lượng tuyến ức tương đối 22 3.4. Ảnh hưởng của pidotimod lên số lượng bạch cầu 24 3.5. Ảnh hưởng của Pidotimod lên chức năng của ĐTB 25 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 27 4.1. Về thiết kế nghiên cứu 27 4.2. Về kết quả nghiên cứu 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Con - A Concanavilin - A CY cyclophosphamid DNCB Dinitrochlorobenzen ĐTB Đại thực bào ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch IFN Interferon IL Interleukin Kl/tt Khối lượng/thể tích KTMD Kích thích miễn dịch LPS Lipopolysaccharide PHA phytohaemagglutinin RCT Nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng p.o Đường uống s.c Tiêm dưới da i.p Tiêm phúc mạc i.v Tiêm tĩnh mạch i.m Tiêm bắp DANH MỤC BẢNG: Bảng Tên bảng Trang 3.1 Sự thay đổi khối lượng chuột 20 3.2 Khối lượng lách tương đối 23 3.3 Khối lượng tuyến ức tương đối 25 3.4 Số lượng bạch cầu 27 3.5 Chỉ số thực bào 29 DANH MỤC HÌNH: Hình Tên hình Trang 2.1 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 17 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, các bệnh liên quan đến virus, liên quan đến phân tử gây suy giảm khả năng miễn dịch của cơ thể như: HIV, ung thư, nhiễm trùng… ngày càng gia tăng. Vậy làm thế nào để hạn chế sự phát triển của bệnh cũng như kéo dài sự sống của người bệnh là vấn đề luôn được xã hội quan tâm. Chất kích thích miễn dịch đã được đưa vào sử dụng như một biện pháp giúp con người chống đỡ với bệnh tật. Các nhà khoa học đã tìm ra một số chất kích thích miễn dịch có ứng dụng cao như: BCG, bronchovaxom, lentinan, levamisol Pidotimod có cấu trúc giống dipeptid là một hóa dược có khả năng kích thích miễn dịch đã được tìm ra bởi hãng Poli Industria Chimica – Italia vào đầu những năm 90 của thập kỷ XX. Nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng khẳng định pidotimod có tác dụng tốt trên hệ miễn dịch. Hiện nay, thuốc đã được đưa vào sản xuất, sử dụng ở nhiều nước trên thế giới với các biệt dược như adimod, imunorix, onaka, pigitil, polimod… Ở Việt Nam, Trường Đại học Dược Hà Nội đã và đang nghiên cứu, tổng hợp pidotimod để làm nguyên liệu sản xuất thuốc. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu thử hoạt tính của thuốc này trên hệ miễn dịch. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Thử nghiệm tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod sản xuất tại Việt Nam trên động vật thí nghiệm” nhằm mục đích: Đánh giá được tác dụng của Pidotimod sản xuất tại Việt Nam lên trọng lượng chuột, trọng lượng tương đối các tổ chức lympho (lách, ức) và số lượng bạch cầu ngoại vi và chức năng đại thực bào hệ lưới nội mô. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về sinh lý miễn dịch 1.1.1. Khái niệm về miễn dịch Miễn dịch (immunity) là khả năng của cơ thể nhận biết, đáp ứng và loại bỏ các yếu tố lạ gây hại. Khi bị yếu tố gây bệnh (kháng nguyên) xâm nhập, trước tiên cơ thể vận hành ngay một số tế bào và phân tử sẵn có để kịp thời ngăn chặn, xử lý, sau đó tạo ra các tế bào và phân tử đặc hiệu tương ứng với từng loại kháng nguyên khác nhau để loại trừ chúng. Phân loại ĐƯMD: gồm 2 loại - ĐƯMD tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu). - ĐƯMD thu được (miễn dịch đặc hiệu) [3], [5]. 1.1.2. Miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immunity) Được hình thành trong quá trình tiến hóa của của động vật để chống lại sự xâm nhập, gây nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh. Miễn dịch không đặc hiệu không để lại trí nhớ, khá ổn định và ít bị sai sót. Các mô, tế bào, phân tử tham gia vào ĐƯMD không đặc hiệu gồm: da, niêm mạc, các tế bào thực bào, hệ thống bổ thể, IFN, … [5]. 1.1.3. Miễn dịch đặc hiệu (specific immunity) Là trạng thái miễn dịch xuất hiện do kháng thể đặc hiệu tương ứng với từng kháng nguyên được tạo ra sau khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên (ngẫu nhiên hoặc chủ động). Miễn dịch đặc hiệu có khả năng nhận dạng được hầu hết kháng nguyên và để lại trí nhớ miễn dịch. Miễn dịch đặc hiệu gồm miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào với sự đảm nhiệm của các tế bào lympho B và lympho T [5]. 1.1.4. Các cơ quan và tế bào tham gia quá trình ĐƢMD 1.1.4.1. Cơ quan lympho trung ương Là nơi sinh sản và biệt hóa tế bào lympho đến trưởng thành, đủ khả năng xử lý kháng nguyên. 3 Tủy xương: Là cơ quan trung ương của mọi tế bào máu, nhạy cảm với tia xạ và các thuốc chống phân bào. Tuyến ức: Đảm nhiệm chức năng huấn luyện, phân chia, biệt hóa, các tế bào lympho T là nhờ một số yếu tố hòa tan (thymulin, thymosin α1, …) [5]. 1.1.4.2. Cơ quan lymopho ngoại vi Là nơi tế bào lympho trú ngụ và biệt hóa dưới tác động của kháng nguyên. Hạch lympho: Được coi như một cái lọc đối với các phân tử lạ ngoại lai và các mảnh vụn từ mô hoại tử, là trung tâm của sự tuần hoàn các tế bào lympho, nơi tế bào tiếp xúc với kháng nguyên. Lách: có nhiệm vụ lọc và dự trữ máu cho cơ thể, ngoài ra còn là nơi tập trung kháng của kháng nguyên vào cơ thể bằng đường máu. Các mô lympho không có vỏ bọc: nằm rải rác ở niêm mạc đường tiêu hóa, hô hấp, tiết niệu,… [5] 1.1.4.3. Các tế bào tham gia quá trình ĐƯMD Lympho bào: chiếm khoảng 20 - 30 % tổng số bạch cầu trong máu, có vai trò chủ chốt trong miễn dịch đặc hiệu. Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, sẽ gặp phải hàng loạt cơ chế bảo vệ tự nhiên không đặc hiệu nhằm tiêu diệt hoặc loại trừ chúng ra khỏi cơ thể. Nếu kháng nguyên vượt qua được hàng rào này, và có đủ thời gian, chúng sẽ gặp phải các chất bảo vệ đặc hiệu trong ĐƯMD đặc hiệu. ĐƯMD đặc hiệu xuất hiện sẽ làm ĐƯMD tự nhiên được tăng cường [5]. Tế bào diệt tự nhiên NK (natural killer): Là một tiểu quần thể tế bào giống lympho, có khả năng diệt một số tế bào đích: tế bào u, tế bào vật chủ nhiễm virus. Chức năng quan trọng của NK là kiểm soát miễn dịch, ngăn chặn sự di cư của tế bào u qua máu, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm virus. Các tế bào NK có thể hạn chế hoặc làm trầm trọng hơn các phản ứng miễn dịch [6], [26], [29]. Tế bào thực bào đơn nhân (monocyte): đóng vai trò phòng thủ do khả năng thực bào các loại ký sinh trùng và vi khuẩn. Các ĐTB còn có vai trò quan trọng trong sự khởi động quá trình miễn dịch đặc hiệu, chúng cần thiết cho việc hoạt hóa các tế bào lympho T và lympho B trước sự xâm nhập của các kháng nguyên ngoại [...]... có tác dụng dược lý trên hệ miễn dịch rất rõ ràng, tác 9 động trên nhiều tế bào, nhiều khâu của quá trình miễn dịch Trong khuôn khổ của bài khóa luận, chúng tôi chỉ trình bày một cách ngắn gọn một số kết quả của các nghiên cứu về các tác dụng của Pidotimod để đưa ra cái nhìn tổng quan nhất về tác dụng của chất điều biến miễn dịch này 1.3.3.1 Các nghiên cứu trên động vật  Tác động lên ĐTB Các thí nghiệm. .. ở lô thử là 8 ngày [17] Pidotimod không phải là thuốc chống virus đặc hiệu Các dữ liệu nghiên cứu toàn cầu chỉ ra rằng, tác dụng của pidotimod không phụ thuộc vào loại virus và không liên quan chặt chẽ đến cơ chế nhân lên của mỗi loại virus [17], [27]  Các tác dụng khác 12 Ngoài tác dụng trên hệ miễn dịch, Pidotimod đã được đánh giá khả năng tác dụng lên các cơ quan khác ở động vật thí nghiệm Trên. .. cấu trúc và chức năng bình thường, nó chỉ có tác dụng rõ rệt đối với hệ miễn dịch đã bị tổn thương, suy giảm hay rối loạn [4] Do vậy, để nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod, chúng tôi sử dụng mô hình nghiên cứu tác dụng của thuốc trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng Cyclophosphamid Có nhiều thuốc có thể gây suy giảm miễn dịch thường được dùng trong nghiên cứu như cyclophosphamid,... - Chỉ số điều trị ở chuột dao động trong khoảng 40 – 80 [15] Như vậy, các khảo sát cho thấy pidotimod khá an toàn, ngoài tác dụng trên hệ thống miễn dịch thì sự tác động tới các hoạt động chức năng khác là không có hoặc không rõ ràng Tính đơn nhất trong tác động của Pidotimod (chỉ trên hệ miễn dịch) là một thuộc tính có lợi trong điều trị, do đó hạn chế được những tác dụng phụ không mong muốn 15 CHƢƠNG... nghiệm trên chuột bị ức chế miễn dịch chứng tỏ pidotimod có tác động tích cực lên chức năng của ĐTB (khả năng hóa ứng động, khả năng sản xuất gốc độc, sản sinh các cytokin gây viêm) [12], [27], [28] - Pidotimod làm tăng tính hóa ứng động của ĐTB: Prednisolon làm giảm khả năng hóa ứng động của các ĐTB xuống còn ¼ so với nhóm chứng (không bị ức chế miễn dịch, p < 0.001), nhưng khi điều trị với pidotimod, ... và tuftsin; thể hiện rõ tác dụng bảo vệ trên chuột đã được gây ức chế miễn dịch, cũng như giúp tăng cường tác dụng kháng khuẩn in vivo của các kháng sinh cefotaxim và ampicillin, theo hướng hỗ trợ hoặc hiệp đồng (kháng sinh diệt vi khuẩn trực tiếp và pidotimod tác động lên hệ miễn dịch làm tăng khả năng tiêu diệt vi khuẩn của cơ thể) [14], [27] - Tác dụng chống virus: Các thí nghiệm đã tiến hành với... trị với pidotimod, khả năng hóa ứng động của ĐTB đã được tăng cường một cách rõ rệt và phục hồi gần như hoàn toàn so với nhóm chứng (kể cả đường uống và tiêm phúc mạc) [12], [28] - Pidotimod kích thích ĐTB tăng cường sản xuất các gốc độc: Sử dụng prednisolon gây suy giảm miễn dịch làm giảm đáng kể quá trình sản xuất các gốc độc của ĐTB khi được ủ với các tác nhân thích hợp (anion superoxid, p < 0,01;... Các khảo sát khác Pidotimod không có tác dụng chống viêm, không gây hạ glucose máu, không gây tê tại chỗ, không ảnh hưởng tới kết tập tiểu cầu hay sự đáp ứng của ruột cô lập thử với histamin, acetylcholin và BaCl2 [24] 1.3.3.2 Các nghiên cứu trên người Các nghiên cứu trên người nhằm mục đích: xác nhận các kết quả thu được ở động vật và kiểm tra các tác động trên hệ miễn dịch của pidotimod với đối với... giảm miễn dịch và được điều trị bằng pidotimod đều tăng lên có ý nghĩa thống kê so với nhóm không được điều trị Các kết quả đều thể hiện pidotimod có khả năng phục hồi các chức năng của hệ miễn dịch qua trung gian tế bào trở về mức bình thường [12], [27] - Trên miễn dịch dịch thể: Đánh giá ĐƯMD dịch thể của pidotimod, người ta sử dụng hai phản ứng với hai kháng nguyên khác nhau (LPS – đối với miễn dịch. .. sang tế bào lympho sản xuất kháng thể quyết định tính đặc hiệu của kháng thể đối với kháng nguyên [3] 1.2.3 Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất KTMD Chất KTMD tác động vào nhiều khâu trong quá trình miễn dịch Vì vậy, các kỹ thuật đánh giá tác dụng của các chất KTMD rất đa dạng và có thể thực hiện theo các khâu chính sau đây: Khâu xử lý kháng nguyên thông qua hoạt động của ĐTB: - Kỹ thuật . đề tài Thử nghiệm tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod sản xuất tại Việt Nam trên động vật thí nghiệm nhằm mục đích: Đánh giá được tác dụng của Pidotimod sản xuất tại Việt Nam lên. DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ ĐIỂM THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI. TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ ĐIỂM THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD SẢN XUẤT TẠI VIỆT NA M TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC