Sự biến đổi trọng lƣợng chuột (SBĐTL)
SBĐTL = trọng lượng sau điều trị – trọng lượng trước điều trị. Khối lƣợng lách tƣơng đối (%)
Khối lƣợng tuyến ức tƣơng đối (%)
Chỉ số thực bào
Khối lượng lách tương đối (%) =
Trọng lượng chuột Khối lượng lách
×100 %
Khối lượng tuyến ức tương đối (%) =
Trọng lượng chuột Khối lượng tuyến ức
×100 %
K =
T1 – T2
OD1 và OD2 là mật độ quang đo tại thời điểm T1 (0 phút) và T2 (15 phút) tương ứng.
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t – test Student. Số liệu được diễn đạt dưới dạng Xtb ± SD. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Sự biến đổi trọng lƣợng chuột
Trong suốt quá trình tiến hành thử nghiệm, trọng lượng chuột được cân bằng cân kỹ thuật và ghi lại để tiện theo dõi ảnh hưởng của thuốc đến trọng lượng và cho uống thuốc đúng liều. Trọng lượng chuột, phần nào nói lên những tác động của thuốc đối với cơ thể.
SBĐTL = trọng lượng sau điều trị – trọng lượng trước điều trị.
Kết quả sự biến đổi trọng lượng chuột trước và sau khi tiêm cyclophosphamid:
Bảng 3.1. Sự biến đổi trọng lƣợng chuột
Lô chuột Trọng lượng (g) Sự biến đổi trọng lượng (g) Ngày thứ 1 Ngày thứ 3 (sử dụng CY) Ngày thứ 13 Chứng sinh học 33,63 ± 1,33 35 ± 2,00 42,13± 2,17**∆∆ +7,13 ± 2,17 Chứng âm 34,00 ± 1,39 34,75 ± 1,49 27,13 ± 3,68∆∆ -7,62 ± 3,02 Pidotimod liều 200mg/kg 33,75 ± 2,60 34,88 ± 2,59 30,63 ± 2,50* ∆∆ -4,25 ± 0,46 Pidotimod liều 400 mg/kg 31,78 ± 2,58 33,38 ± 2,50 28,25 ± 1,75 ∆∆ -5,11 ± 1,09
Dấu (–) thể hiện sự giảm khối lượng, dấu (+) thể hiện sự tăng khối lượng. *: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,01 so với nhóm chứng âm.
∆: p ≤ 0, 05; ∆∆: p≤ 0,01 so với trọng lượng trước khi gây bệnh (ngày thứ 3).
Nhận xét:
- Trước khi sử dụng CY để gây suy giảm miễn dịch (2 ngày đầu), trọng lượng trung bình của các lô chuột tăng không đáng kể, và giữa các lô chuột khác nhau không đáng kể (p > 0.05).
- Sau khi gây suy giảm miễn dịch và tiếp tục điều trị bằng pidotimod (thời gian là 10 ngày kể từ khi bắt đầu sử dụng CY), trọng lượng chuột có sự thay đổi rõ rệt, trọng lượng chuột ở lô chứng âm giảm so với lô chứng sinh học có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Trọng lượng chuột ở lô chứng sinh học tăng lên 7,13 (g) so với thời điểm 3 ngày sau khi bắt đầu thí nghiệm, còn trọng lượng chuột ở các nhóm có sử dụng CY đều giảm lần lượt là 7,62 g; 4,25 g; 5,11 g tương ứng với các lô chứng âm, thử liều thấp và thử liều cao.
- Sau thời gian điều trị, trọng lượng chuột ở lô pidotimod liều 200 mg/kg tăng 12,9% có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng âm (p < 0,05); trọng lượng chuột ở lô thử liều cao (400 mg/kg) tăng 4,2% so với lô chứng âm (p > 0,05). Trọng lượng tuy có phục hồi nhưng vẫn thấp hơn so với mức ban đầu. Trọng lượng trung bình của từng lô chuột trước và sau khi gây suy giảm miễn dịch khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).
- Sau điều trị, trọng lượng trung bình giữa 2 lô thử với liều 200 mg/kg và 400 mg/kg khác nhau đáng kể (p < 0,05).
- Trọng lượng giữa các cá thể trong từng nhóm chuột có sự chênh lệch khá nhiều, nhất là sau thời gian điều trị (SD khá cao).
3.2. Ảnh hƣởng của Pidotimod lên trọng lƣợng lách tƣơng đối
Lách là cơ quan lympho ngoại vi, nơi trú ngụ của các tế bào lympho. Vùng tủy trắng của lách được cấu tạo chủ yếu là các mô lympho bị ảnh hưởng nhiều của các thuốc chống phân bào, gây suy giảm miễn dịch. Đánh giá trọng lượng lách tương đối (so với trọng lượng chuột để giảm bớt sai số do sự phụ thuộc giữa trọng lượng lách và trọng lượng cơ thể) nhằm xác đinh ảnh hưởng của pidotimod trên chuột bị suy giảm miễn dịch. Lách sau khi được bộc lộ và tách riêng, được cân bằng cân kỹ thuật có sai số là 0,01 g.
Kết quả sự khác nhau trọng lượng lách tương đối giữa các nhóm chuột được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.2. Trọng lƣợng lách tƣơng đối
Lô chuột N Trọng lượng lách tương đối Tỷ lệ so với chứng âm Chứng sinh học 8 0,523 ± 0,118 0,68 Chứng âm 8 0,770 ± 0,148∆∆ 1,00 Pidotimod liều 200 mg/kg 8 0,654 ± 0,112∆ 0,85 Pidotimod liều 400 mg/kg 8 0,557 ± 0,036** 0,72
*: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,01 so với lô chứng âm. ∆
: p ≤ 0,05; ∆∆: p ≤ 0,01 so với lô chứng sinh học.
Nhận xét:
- Cyclophosphamid làm tăng đáng kể trọng lượng lách tương đối ở chuột nhắt trắng. Trọng lượng lách tương đối của lô chứng âm tăng 32% so với lô chứng sinh học (p < 0,01).
- Pidotimod ở cả hai liều có tác dụng làm hạn chế sự gia tăng này:
Pidotimod liều 400 mg/kg có tác dụng rõ rệt hơn, trọng lượng lách tương đối giảm 28% so với lô chứng âm (p < 0,01), trọng lượng lách ở nhóm này cao hơn 6,5% so với nhóm chứng sinh học, sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Lô chuột dùng pidotimod liều 200 mg/kg, làm giảm 15% trọng lượng lách tương đối so với lô chứng âm, tuy nhiên sự khác nhau giữa 2 nhóm này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
- Sự chênh lệch giữa các cá thể trong các lô sinh học, chứng âm, thử liều thấp cũng có sự biến đổi lớn (SD cao).
3.3. Ảnh hƣởng của pidotimod lên trọng lƣợng tuyến ức tƣơng đối
Tuyến ức là một tuyến quan trọng trong hệ miễn dịch, là một cơ quan lympho trung ương, nơi huấn luyện, phân chia, biệt hóa, các tế bào lympho T. Vùng vỏ chiếm phần lớn khối lượng tuyến ức, gồm chủ yếu là các tế bào dạng lympho, một
số tế bào biểu mô xen kẽ và một ít ĐTB. Do đó, chịu ảnh hưởng nhiều của thuốc chống phân bào như CY. Đánh giá sự khác nhau về trọng lượng tuyến ức tương đối giữa các lô chuột để xem xét một phần ảnh hưởng của các thuốc lên cấu tạo và chức năng của tuyến ức.
Sự khác nhau về trọng lượng tuyến ức tương đối giữa các lô chuột được biểu diễn trong bảng sau:
Bảng 3.3. Trọng lƣợng tuyến ức tƣơng đối
Lô chuột N Trọng lượng tuyến ức tương đối Tỷ lệ so với nhóm chứng âm Chứng sinh học 8 0,143 ± 0,049 3,40 Chứng âm 8 0,042 ± 0,029∆∆ 1,00 Pidotimod liều 200 mg/kg 8 0,135 ± 0,049** 3,21 Pidotimod liều 400 mg/kg 8 0,134 ± 0,025** 3,19
*: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,01 so với lô chứng âm. ∆
: p ≤ 0,05; ∆∆: p ≤ 0,01 so với lô chứng sinh học.
Nhận xét:
- Trọng lượng tuyến ức tương đối ở lô chứng âm giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học, giảm 3,4 lần so với lô chứng sinh học ( p < 0,01).
- Các lô thử dùng pidotimod ở cả 2 liều 200 mg/kg và 400 mg/kg đều làm tăng trọng lượng tuyến ức tương đối so với lô chứng âm, lần lượt tăng lên 3,21 và 3,19 lần so với lô chứng âm (p < 0,01).
- Trọng lượng tuyến ức tương đối ở hai lô dùng pidotimod với liều 200 mg/kg và lô 400 mg/kg lần lượt đạt 94,4% và 93,7% so với lô chứng sinh học. Sự khác nhau về trọng lượng tuyến ức tương đối giữa các lô chứng sinh học, hai lô dùng pidotimod không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
- Khoảng dao động của trọng lượng tuyến ức tương đối giữa các cá thể trong một nhóm khá lớn (SD cao).
3.4. Ảnh hƣởng của pidotimod lên số lƣợng bạch cầu
Bạch cầu là thành phần không thể thiếu trong hệ miễn dịch. Đó là các tế bào đảm nhiệm chức năng chính trong việc bảo vệ cơ thể trước nguy cơ xâm nhập của các kháng nguyên ngoại lai có hại. Một hệ miễn dịch khỏe mạnh phải đảm bảo số lượng và chất lượng của các tế bào này. Vì vậy số lượng bạch cầu thường được sử dụng để đánh giá về tác dụng của một thuốc trên hệ miễn dịch. Mặc dù không phải là một chỉ số đặc hiệu để đánh giá tác dụng của một thuốc, nhưng lại là một chỉ số quan trọng trong đánh giá đáp ứng chung của hệ miễn dịch. Đối với pidotimod cũng vậy, số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi là một trong các chỉ số dùng để đánh giá ảnh hưởng của thuốc trên hệ miễn dịch.
Số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi được đếm bằng máy đếm bạch cầu tự động, kết quả được biểu diễn trong bảng sau:
Bảng 3.4. Số lƣợng bạch cầu
Lô chuột N Số lượng bạch cầu (×10
3 tế bào/ml) Tỷ lệ Chứng sinh học 8 17,113 ± 8,994 3,69 Chứng âm 8 4,638 ± 1,036∆∆ 1,00 Pidotimod liều 200 mg/kg 8 10,775 ± 3,541**∆ 2,32 Pidotimod liều 400 mg/kg 8 12,912 ± 5,780** 2,78
*: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,01 so với lô chứng âm. ∆
: p ≤ 0,05; ∆∆: p ≤ 0,01 so với lô chứng sinh học.
Nhận xét:
- Từ bảng trên ta thấy, sử dụng CY làm giảm rõ rệt số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi, giảm 3,69 lần so với lô chứng sinh học (p < 0,01).
- Các lô sử dụng thuốc pidotimod để điều trị, số lượng bạch cầu có tăng lên đáng kể so với lô chỉ sử dụng CY. Số lượng bạch cầu ở lô pidotimod liều 200 mg/kg tăng 2,32 lần so với lô chứng âm (p < 0,01); lô pidotimod liều 400 mg/kg tăng 2,78 lần so với lô chứng âm (p < 0,01).
- Số lượng bạch cầu ở hai lô pidotimod liều 200 mg/kg và 400 mg/kg lần lượt bằng 62,96 % và 75,45% so với chứng sinh học. Số lượng bạch cầu ở lô pidotimod liều 200 mg/kg thấp hơn đáng kể so với chứng sinh học (p < 0,05).
- Pidotimod liều 400 mg/kg có tác dụng mạnh hơn so với pidotimod liều 200 mg/kg, tuy nhiên, số lượng bạch cầu ở 2 lô này khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
- Sự chênh lệch về số lượng bạch cầu giữa các cá thể trong một lô khá lớn (SD cao) nhất là ở lô chứng sinh học, SD = 8,994. Sự chênh lệch lớn này thể gây ra nhiều sai số khi so sánh, thống kê. Có thể do số lượng chuột trong một lô tương đối ít (N=8) đã gây ra sự chênh lệch này.
3.5. Ảnh hƣởng của Pidotimod lên chức năng của ĐTB
ĐTB là tế bào bạch cầu đơn nhân, hệ thống các ĐTB trong cơ thể còn được gọi là hệ thống lưới nội mô giữ vai trò quan trọng trong cả hệ miễn dịch không đặc hiệu và miễn dịch đặc hiệu. ĐTB có khả năng hóa ứng động và thực bào. Khi cơ thể bị kháng nguyên xâm nhập sẽ hoạt hóa các ĐTB đến để thực bào và tiêu hóa các kháng nguyên. Đồng thời, các ĐTB sẽ truyền lại các thông tin về kháng nguyên cho các tế bào lympho tạo thành trí nhớ miễn dịch, giúp nhận diện và chống lại các kháng nguyên này trong các lần xâm nhập tiếp theo. Vì vậy, hệ thống lưới nội mô là hàng rào đắc lực trong việc bảo vệ cơ thể trước nguy cơ bệnh tật. Đánh giá khả năng thực bào là một trong các test dùng để đánh giá hoạt động, chức năng của hệ thống lưới nội mô.
Chỉ số thực bào (K) được tính dựa vào nồng độ carbon trong máu tại hai thời điểm khác nhau (0 phút và 15 phút) trong phép đo độ thanh thải carbon.
Bảng 3.5. Chỉ số thực bào
Lô chuột N Mật độ quang tại 0 phút Mật độ quang tại 15 phút Chỉ số thực bào Tỷ lệ Chứng sinh học 8 0,082 ± 0,048 0,041 ± 0,026 0,053 ± 0,026 3,12 Chứng bệnh lý 8 0,120 ± 0,030 0,093 ± 0,024 0,017 ± 0,009 ∆∆ 1,00 Pidotimod 200 mg/kg 8 0,123 ± 0,039 0,069 ± 0,015 0,037 ± 0,013* 2,18 Pidotimod 400 mg/kg 8 0,111 ± 0,020 0,067 ± 0,018 0,036 ± 0,018 2,12
*: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,01 so với lô chứng âm. ∆
: p ≤ 0,05; ∆∆: p ≤ 0,01 so với lô chứng sinh học.
Nhận xét:
- Từ bảng và hình trên cho thấy sử dụng CY làm giảm đáng kể độ thanh thải carbon ở trong máu. Chỉ số thực bào của lô chứng âm thấp hơn 3,12 lần so với lô chứng sinh học (p < 0,01).
- Lô sử dụng Pidotimod liều 200 mg/kg có chỉ số thực bào tăng lên đáng kể so với lô chứng âm, tăng lên 2,18 lần (p < 0,05); liều 400 mg/kg, chỉ số thực bào tăng lên 2,12 lần so với lô chứng âm (p > 0,05).
- Chỉ số thực bào ở lô sử dụng pidotimod liều 200 mg/kg đạt 69,8%, lô dùng liều 400mg/kg giảm 67,9% so với lô chứng sinh học (p > 0,05).
- Chỉ số thực bào ở hai lô dùng pidotimod với 2 mức liều (400 mg/kg và 200 mg/kg) khác nhau không đáng kể (p > 0,05).
- Sự chênh lệch về chỉ số thực bào giữa các cá thể trong nhóm khá lớn (SD cao), nhất là nhóm chứng sinh học (SD = 0,026).
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về thiết kế nghiên cứu
Có nhiều phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng điều hòa miễn dịch của một thuốc. Dựa trên các nguyên lý khác nhau, tùy thuộc vào mục tiêu đánh giá mà sử dụng các phương pháp như đã nêu trong mục 1.2.3. Ở đây, chúng tôi sử dụng phương pháp đo độ thanh thải carbon đánh giá chức năng của ĐTB hệ lưới nội mô và sử dụng các chỉ số về trọng lượng cơ thể, trọng lượng lách tương đối, trọng lượng tuyến ức tương đối và số lượng bạch cầu khảo sát tác dụng KTMD của pidotimod. Phương pháp này được sử dụng khá nhiều trên thế giới để đánh giá tác dụng trên hệ miễn dịch của nhiều thuốc. So với các phương pháp khác, phương pháp này thực hiện khá đơn giản và rẻ tiền, kết quả có độ chính xác cao.
Sau khi nghiên cứu một số báo cáo thử tác dụng trên hệ miễn dịch của các thuốc khác nhau về phương pháp này [8], [12], [14], [20], [22], chúng tôi đã sử dụng cyclophosphamid làm chất gây suy giảm miễn dịch, sử dụng mực pelikan – 4001 để làm kháng nguyên ngoại lai, sử dụng phương pháp đo quang tại bước sóng ánh sáng đỏ để xác định nồng độ carbon và tiến hành đánh giá trên các chỉ số: khối lượng chuột, khối lượng lách tương đối, khối lượng tuyến ức tương đối, số lượng bạch cầu ngoại vi, chỉ số thực bào.
Phần lớn các chất kích thích miễn dịch (immunostimulant) hoặc điều biến miễn dịch (immunomodulatory) không có hoặc ít có tác dụng đối với hệ miễn dịch có cấu trúc và chức năng bình thường, nó chỉ có tác dụng rõ rệt đối với hệ miễn dịch đã bị tổn thương, suy giảm hay rối loạn [4]. Do vậy, để nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod, chúng tôi sử dụng mô hình nghiên cứu tác dụng của thuốc trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng Cyclophosphamid.
Có nhiều thuốc có thể gây suy giảm miễn dịch thường được dùng trong nghiên cứu như cyclophosphamid, cycloprorin A, methotrexat, các thuốc chống viêm steroid (dexamethason, prednisolon) và yêu cầu chung đặt ra là các thuốc này phải gây suy giảm miễn dịch một cách rõ rệt so với nhóm đối chứng. Do đó, tùy vào đối tượng nghiên cứu và mục tiêu nghiên cứu để sử dụng thuốc gây suy giảm miễn
dịch nào cho hợp lý. Đối với thí nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng cyclophosphamide để gây suy giảm miễn dịch ở chuột với liều 120 mg/kg trong 3 ngày liên tiếp và kết quả là lô chứng âm có số lượng bạch cầu và các chỉ số khác giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học.
CY là nằm trong danh mục thuốc thiết yếu, được xếp vào nhóm thuốc ức chế miễn dịch, có tác dụng alkyl hóa ADN, do đó có tác dụng ngăn chặn sự sao chép và phiên mã ADN. CY ức chế chung sự phân chia của tất cả các tế bào đang tăng sinh, đặc biệt là các tế bào tủy xương và các tế bào biểu mô đường tiêu hóa. Vì vậy gây ra những tác dụng không mong muốn trên nhiều cơ quan và mô. CY gây giảm không chọn lọc tất cả các dòng tế bào, kể cả bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu. Số lượng bạch cầu trong máu thấp nhất thường thấy sau 10 – 12 ngày điều trị [2]. CY