Đánh giá mức độ kích thích miễn dịch của pidotimod việt nam sản xuất và dạng pha chế dùng uống trên động vật thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ KIM KHUYÊN ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD VIỆ T NAM SẢN XUẤT VÀ DẠNG PHA CHẾ DÙNG UỐNG TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ KIM KHUYÊN ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD VIỆT NAM SẢN XUẤT VÀ DẠNG PHA CHẾ DÙNG UỐNG TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ SỐ: 60720408 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Rư PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng HÀ NỘI, NĂM 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới người thầy: TS. Nguyễn Văn Rư – GV Bộ môn Hóa Sinh – trường Đại học Dược Hà Nội và PGS.TS. Vũ Mạnh Hùng – Trưởng bộ môn duợc lý – Học viện quân y đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô, các kỹ thuật viên – Bộ môn Hóa Sinh và bộ môn Dược Lực - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội – những người thầy đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập thạc sỹ tại trường. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành luận văn. Hà nội, ngày 20 tháng 07 năm 2014 Học viên Đặng Thị Kim Khuyên MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG: 5 DANH MỤC HÌNH: 5 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Một số nghiên cứu về Pidotimod 3 1.1.1. Cấu trúc hóa học của Pidotimod 3 1.1.2. Dược động học của Pidotimod 3 1.1.3. Tác dụng dược lý của pidotimod 4 1.1.4. Độc tính và tương tác thuốc 10 1.2. Tổng quan về sinh lý miễn dịch 11 1.2.1. Khái niệm về miễn dịch 11 1.2.2. Miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immunity) 11 1.2.3. Miễn dịch đặc hiệu (specific immunity) 12 1.2.4. Các cơ quan và tế bào tham gia quá trình ĐƯMD 12 1.2.5. Tổng quan về sinh lý bệnh suy giảm miễn dịch: 14 1.3. Chất kích thích miễn dịch và nguyên lý đánh giá tác dụng 16 1.3.1. Khái niệm 16 1.3.2. Cơ chế tác dụng của các chất KTMD 16 1.3.3. Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất KTMD . 17 1.4 Các kỹ thuật đã được sử dụng để đánh giá tác dụng KTMD của Pidotimod 18 1.4.1. Tác động lên miễn dịch tế bào 18 1.4.2. Tác động trên quá trình miễn dịch dịch thể 22 1.4.3. Tác động trên các đại thực bào 24 1.4.4. Tác động không đặc hiệu trên hệ lưới nội mô: độ thanh thải keo mực Tàu 25 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu 27 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị 27 2.2.1. Nguyên liệu 27 2.2.2. Thuốc và hóa chất 27 2.2.3. Thiết bị 27 2.3. Nội dung nghiên cứu 28 2.4. Thiết kế nghiên cứu 28 2.4.1. Chuẩn bị 28 2.4.2. Tiến hành thí nghiệm 30 2.4.3. Một số chỉ tiêu đánh giá trong thí nghiệm 31 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 33 3.1. Sự biến đổi khối lượng chuột 33 3.2. Ảnh hưởng của Pidotimod lên khối lượng lách tương đối 35 3.3. Ảnh hưởng của pidotimod lên khối lượng tuyến ức tương đối 37 3.4. Ảnh hưởng của pidotimod lên số lượng bạch cầu 39 3.5. Ảnh hưởng của Pidotimod lên chức năng của thực bào của lưới nội mô. 41 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 45 4.1. Về lựa chọn mức liều và phương pháp thử nghiệm Pidotimod. 45 4.2. Về kết quả nghiên cứu 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO . PHỤ LỤC……………………………………………………………………… CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Con - A Concanavilin – A CY Cyclophosphamid CT Công thức DNCB Dinitrochlorobenzen ĐTB Đại thực bào ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch IFN Interferon IL Interleukin i.m Tiêm bắp i.p Tiêm phúc mạc i.v Tiêm tĩnh mạch Kl/tt Khối lượng/thể tích KTMD Kích thích miễn dịch LPS Lipopolysaccharide NTHHC Nhiễm trung hô hấp cấp PHA Phytohaemagglutinin p.o Đường uống RCT Nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng s.c Tiêm dưới da DANH MỤC BẢNG: Bảng Tên bảng Trang 3.1 Sự thay đổi khối lượng chuột 33 3.2 Khối lượng lách tương đối 36 3.3 Khối lượng tuyến ức tương đối 38 3.4 Số lượng bạch cầu 40 3.5 Chỉ số thực bào 43 DANH MỤC HÌNH: Hình Tên hình Trang 2.1 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 30 3.2 Khối lượng chuột 34 3.3 Sự thay đổi khối lượng chuột 34 3.4 Khối lượng lách tương đối 36 3.5 Khối lượng tuyến ức tương đối 38 3.6 Số lượng bạch cầu 40 3.7 Chỉ số thực bào 40 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Y học hiện đại đang phải đối mặt với nguy cơ gia tăng cao của các nhóm bệnh nguy hiểm như: HIV, ung thư, nhiễm khuẩn các vi khuẩn đề kháng thuốc…. Nguyên nhân của những bệnh này là hệ miễn dịch của người bệnh bị suy giảm do các tác nhân môi trường, hóa chất, thuốc… Từ cuối những năm 1990 nhiễm trùng đường hô hấp cấp (NTHHC) được gọi là "đại dịch bị lãng quên, với một sự phân hóa rõ ràng giữa các nước đang phát triển và các nước công nghiệp hóa về tỷ lệ tử vong và tỷ lệ mắc bệnh liên quan đến NTHHC [7]. Thực trạng này vẫn đúng trong hơn 20 năm tiếp theo, khi sự ra đời của thuốc kháng sinh và vắc-xin mới góp phần kiểm soát các dạng NTHHC đe dọa mạng sống nhất, nhưng không kiểm soát được nhiều các dạng NTHHC do virus. Virus là tác nhân chính chịu trách nhiệm về NTHHC trong độ tuổi trẻ em. Một cách tiếp cận tích cực trong việc ngăn chặn và điều trị NTHHC là tăng cường miễn dịch không đặc hiệu và tăng cường cơ chế phòng vệ bẩm sinh ở trẻ. Các chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp với cơ chế tác dụng khác nhau đã được giới thiệu ở nhiều nước để ngăn chặn NTHHC ở trẻ. Các chất kích thích miễn dịch đã được tìm thấy và có nguồn gốc rất đa dạng như: interleukin (IL), interferon (IFN), BCG, bronchovaxom, lentinan, levamisol imuthiol… Các chất kích thích miễn dịch này đã được sử dụng và có hiệu quả rất khả quan. Pidotimod là một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu đã được phát triển bởi hãng Poli Industria Chimica – Italia. Đây là một phân tử dipeptid có tác dụng kích thích miễn dịch và đã được sử dụng trong điều trị ở 2 nhiều nước trên thế giới như Mexico, Costa Rica, Nga, Italia, Georgia, Hy lạp, Hàn Quốc, Trung Quốc… Một số biệt dược của Pidotimod được lưu hành ở các nước phát triển như: Adimod, Imunorix, Onaka, Pigitil, Polimod…. Hiện nay các nghiên cứu về bào chế pidotimod trên thế giới đang tập trung vào hướng làm tăng cường chất lượng và sinh khả dụng của các dạng thành phẩm pidotimod [33], [42], [43], [32] Trong thời gian gần đây Pidotimod đã được bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội nghiên cứu và tổng hợp thành công ở dạng bột nguyên liệu thô. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá mức độ kích thích miễn dịch của Pidotimod Việt Nam sản xuất và dạng pha chế dùng uống trên động vật thí nghiệm” nhằm đánh giá tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod được tổng hợp ở Việt Nam với mục tiêu là: 1. Đánh giá được mức độ kích thích miễn dịch của Pidotimod dạng nguyên liệu sản xuất ở Việt Nam 2. Đánh giá được hiệu quả kích thích miễn dịch của Pidotimod sản xuất tại Việt Nam dưới dạng pha chế dung dịch uống. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Một số nghiên cứu về Pidotimod 1.1.1. Cấu trúc hóa học của Pidotimod  Danh pháp - Tên theo danh pháp quốc tế: Pidotimod. - Tên khoa học: acid (R)-3-[(S)-(5-oxo-2-pyrrolidinyl)carbonyl]- thiazolidine-4-carboxylic. - Mã ATC: L03AX05 [21], [27], [48].  Công thức hóa học - Công thức phân tử: C 9 H 12 N 2 O 4 S. - Khối lượng phân tử: 244,26 g/mol. - Công thức cấu tạo: [21], [27].  Tính chất lý hóa - Bột tinh thể không mùi, màu trắng hoặc trắng ngà. - Điểm chảy 194 o C–198 o C, sự chảy kèm theo phân hủy nhanh chóng. - Năng suất quay cực [α] 25 D : 150 o C. - Độ tan của Pidotimod trong nước là 37,8 (g/l) [21]. 1.1.2. Dược động học của Pidotimod Trên động vật (chuột, chó): Pidotimod hấp thu nhanh qua đường uống, tốc độ thải trừ nhanh (T 1/2 = 1 giờ), thể tích phân bố lớn, thuốc phân bố nhanh vào các cơ quan chính, đặc biệt là gan và thận. Sự bài tiết qua nước tiểu ở dạng không chuyển đổi là 75,6% sau tiêm tĩnh mạch và 31,1% sau uống. Sinh [...]... nghiệm, trên động vật thí nghiệm và trên người trước đây cho thấy pidotimod có tác dụng dược lý trên hệ miễn dịch rất rõ ràng, tác động trên nhiều tế bào, nhiều khâu của quá trình miễn dịch 1.1.3.1 Các nghiên cứu trên động vật  Tác động lên đại thực bào Các thí nghiệm trên chuột bị ức chế miễn dịch chứng tỏ pidotimod có tác động tích cực lên chức năng của ĐTB (khả năng hóa ứng động, khả năng sản xuất. .. thử nghiệm cho thấy pidotimod có tác dụng đáng kể giúp vật chủ hạn chế được tác động của Toxoplasma gondii và kéo dài thời gian sống của chuột nhiễm bệnh [30], [50]  Các tác dụng khác Ngoài tác dụng trên hệ miễn dịch, Pidotimod đã được đánh giá khả năng tác dụng lên các cơ quan khác ở động vật thí nghiệm Trên hệ thần kinh - Pidotimod không có tác động lên hệ thần kinh [37] Trên hệ tim mạch - Cơ bản pidotimod. .. số lượng bạch cầu máu ngoại vi trên 2 mức liều 200mg/kg và 400mg/kg - Đánh giá ảnh hưởng của pidotimod sản xuất tại Việt Nam và Pidotimod nước ngoài dưới dạng pha chế dung dịch uống lên khối lượng chuột, khối lượng lách tương đối, khối lượng tuyến ức tương đối và số lượng bạch cầu máu ngoại vi trên mức liều 200mg/kg 2.4 Thiết kế nghiên cứu 2.4.1 Chuẩn bị  Động vật thí nghiệm: Chuột sau khi nuôi cho... pidotimod sản xuất tại Việt Nam dưới dạng pha chế dung dịch uống được thử với mức liều 200 mg/kg: Chuột bị suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid liều 120 mg/kg/ngày tiêm phúc mạc trong 3 ngày và được điều trị bằng pidotimod liều 200 mg/kg - Lô 6 (n = 16) pidotimod sản xuất tại nước ngoài (121808-62-6) dưới dạng pha chế dung dịch uống được thử với mức liều 200 mg/kg: Chuột bị suy giảm miễn dịch bằng... bệnh tự miễn (thấp khớp) , chính là do sự suy giảm miễn dịch Như vậy, ĐƯMD là một quá trình phức tạp xảy ra khi có sự tiếp xúc của kháng nguyên ngoại lai và hệ miễn dịch Điều hòa hoạt động của hệ miễn dịch, giữ cân bằng nội môi cần có sự tham gia và phối hợp của nhiều cơ quan, tổ chức và tế bào sẽ giúp cho cơ thể chống lại các kháng khuyên gây bệnh 1.3 Chất kích thích miễn dịch và nguyên lý đánh giá tác... rằng pidotimod làm tăng cường chức năng của ĐTB M2 [29]  Pidotimod kích thích ĐTB tăng cường sản xuất các gốc độc Khi sử dụng prednisolon gây suy giảm miễn dịch và ủ cùng các tác nhân thích hợp sẽ làm giảm đáng kể quá trình sản xuất các gốc độc của ĐTB (anion superoxid, p < 0,01; NO, p < 0,001) Và khi điều trị cùng với pidotimod thì sự ức chế này gần như bị loại bỏ, đưa lượng NO, superoxid trở về mức. .. Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất KTMD Chất KTMD tác động vào nhiều khâu trong quá trình miễn dịch Vì vậy, các kỹ thuật đánh giá tác dụng của các chất KTMD rất đa dạng và có thể thực hiện theo các khâu chính sau đây: Khâu xử lý kháng nguyên thông qua hoạt động của ĐTB: - Kỹ thuật ức chế di tản ĐTB - Kỹ thuật điện di ĐTB - Kỹ thuật ức chế dính bạch cầu - Kỹ thuật ức chế trải giăng bạch... bằng kính hiển vi trên 10 vùng 1.4.4 Tác động không đặc hiệu trên hệ lưới nội mô: độ thanh thải keo mực Tàu Các phép đo được thực hiện theo phương pháp của Biozzi và cộng sự [11] Sáu nhóm, mỗi nhóm gồm 5-8 cá thể chuột (cân nặng khoảng 20g) được đưa vào thử nghiệm: nhóm chứng không ức chế miễn dịch (dùng nước muối sinh lý), nhóm chứng ức chế miễn dịch, nhóm ức chế miễn dịch + sử dụng pidotimod (100-200... gốc độc, sản sinh các cytokin gây viêm) [17], [45], [47]  Pidotimod làm tăng tính hóa ứng động của ĐTB Prednisolon làm giảm khả năng hóa ứng động của các ĐTB xuống còn 1/4 so với nhóm chứng (không bị ức chế miễn dịch, p < 0,001), nhưng khi điều trị với pidotimod, khả năng hóa ứng động của ĐTB đã được tăng cường một cách rõ rệt và phục hồi gần như hoàn toàn so với nhóm chứng (kể cả đường uống và tiêm... giảm miễn dịch và được điều trị bằng pidotimod đều tăng lên có ý nghĩa thống kê so với nhóm không được điều trị Các kết quả đều thể hiện pidotimod có khả năng phục hồi các chức năng của hệ miễn dịch qua trung gian tế bào trở về mức bình thường [17], [45] - Trên miễn dịch dịch thể: Đánh giá ĐƯMD dịch thể của pidotimod, người ta sử dụng hai phản ứng với hai kháng nguyên khác nhau (LPS – đối với miễn dịch . cứu và tổng hợp thành công ở dạng bột nguyên liệu thô. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài Đánh giá mức độ kích thích miễn dịch của Pidotimod Việt Nam sản xuất và dạng pha chế dùng uống trên động. trên động vật thí nghiệm nhằm đánh giá tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod được tổng hợp ở Việt Nam với mục tiêu là: 1. Đánh giá được mức độ kích thích miễn dịch của Pidotimod dạng nguyên. ĐẶNG THỊ KIM KHUYÊN ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD VIỆT NAM SẢN XUẤT VÀ DẠNG PHA CHẾ DÙNG UỐNG TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN