mực Tàu
Các phép đo được thực hiện theo phương pháp của Biozzi và cộng sự
[11]. Sáu nhóm, mỗi nhóm gồm 5-8 cá thể chuột (cân nặng khoảng 20g) được
đưa vào thử nghiệm: nhóm chứng không ức chế miễn dịch (dùng nước muối
sinh lý), nhóm chứng ức chế miễn dịch, nhóm ức chế miễn dịch + sử dụng pidotimod (100-200 mg/kg thể trọng/ngày đường tiêm phúc mạc và 200 - 400mg/kg thể trọng/ngày theo đường uống). Pidotimod được cho dùng
26
1lần/ngày trong 12 ngày; Cyclophosphamid (liều 120mg/kg thể trọng) gây ức chế miễn dịch được tiêm phúc mạc vào các thứ 3, thứ 4 và ngày thứ 5.
Vào ngày thứ 13 tất cả các cá thể chuột được tiêm tĩnh mạch keo mực Tàu pha loãng (nồng độ 0,32ml/ml nước muối sinh lý). 10µl mẫu máu (bằng cách lấy từ hốc mắt) được thu thập ngay trước và sau 1-10-20 phút khi tiêm mực; mỗi mẫu được thêm vào 3ml HCl 0,1 N. Kết quả được thu thập dựa trên thông tin từ quang phổ ở 640 nm: vẽ và tính toán độ dốc đường cong thanh thải mực Tàu
27
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, khỏe mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung Ương cung cấp, khối lượng trung bình 20 ± 2 g.
Tất cả động vật trên sau khi mua về được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn, nước uống, độ ẩm, và ánh sáng tại khu nghiên cứu động vật thực
nghiệm của Bộ môn Dược Lực, trường Đại học Dược Hà Nội. Chuột được
nuôi một tuần trước khi tiến hành thử nghiệm để làm quen với môi trường. Khi tiến hành thí nghiệm chuột đạt khối lượng 35 – 40g.
2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.2.1. Nguyên liệu
- Pidotimod Việt Nam do bộ môn Hóa dược trường đại học Dược Hà Nội cung cấp (tiêu chuẩn cơ sở do bộ môn Hóa dược xây dựng).
- Pidotimod dạng bột nguyên liệu nước ngoài do công ty Joyochem cung cấp (tiêu chuẩn nguyên liệu do hãng sản xuất cung cấp).
2.2.2. Thuốc và hóa chất
- Cyclophosphamid (biệt dược endoxan). - Mực pelikan – 4001 (Đức). - HCl 0,1N. - Nước muối sinh lý 0,9%. - Natri Saccharin. - Methyl Paraben - Propyl Paraben - Dung dịch NaOH 0,1N. 2.2.3. Thiết bị
28 - Cân kỹ thuật, cân phân tích. - Máy lắc Vortex.
- Ống đựng máu chứa chất chống đông EDTA do công ty thiết bị
y tế Quang Minh cung cấp ( nơi sản xuất: công ty Hồng Thiện Mỹ - Việt Nam)
- Máy đếm bạch cầu tự động (tại trường Đại học Y Hà Nội).
- Micropipett (0,5µl – 10 µl).
- Máy ly tâm.
- Máy đo quang UV-VIS 2960, tại bộ môn Hóa Sinh, trường Đại
học Dược Hà Nội.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá ảnh hưởng của pidotimod dạng nguyên liệu sản xuất tại Việt Nam lên khối lượng chuột, khối lượng lách tương đối, khối lượng tuyến ức tương đối và số lượng bạch cầu máu ngoại vi trên 2 mức liều 200mg/kg và 400mg/kg (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đánh giá ảnh hưởng của pidotimod sản xuất tại Việt Nam và Pidotimod nước ngoài dưới dạng pha chế dung dịch uống lên khối lượng chuột, khối lượng lách tương đối, khối lượng tuyến ức tương đối và số lượng bạch cầu máu ngoại vi trên mức liều 200mg/kg.
2.4. Thiết kế nghiên cứu 2.4.1. Chuẩn bị
Động vật thí nghiệm: Chuột sau khi nuôi cho quen với điều kiện môi trường mới, được tiến hành chia lô ngẫu nhiên, và đánh dấu. Chia chuột thí nghiệm thành các lô như sau:
- Lô 1 (n = 16) chứng sinh học: chuột bình thường, không gây tổn
29
- Lô 2 (n = 16) chứng bệnh lý: chuột bị gây tổn thương miễn dịch bằng cyclophosphamid liều 120 mg/kg/ngày trong 3 ngày, tiêm phúc mạc
và không được điều trị bằng pidotimod.
- Lô 3 (n = 16) pidotimod sản xuất tại Việt Nam với mức liều 200 mg/kg: chuột bị suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid liều 120 mg/kg/ngày tiêm phúc mạc trong 3 ngày và được điều trị bằng pidotimod liều 200 mg/kg.
- Lô 4 (n = 16) pidotimod sản xuất tại Việt Nam với mức liều 400 mg/kg: chuột bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid liều 120 mg/kg/ngày, tiêm phúc mạc trong 3 ngày và được điều trị bằng pidotimod liều 400 mg/kg.
- Lô 5 (n = 16) pidotimod sản xuất tại Việt Nam dưới dạng pha chế dung dịch uống được thử với mức liều 200 mg/kg: Chuột bị suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid liều 120 mg/kg/ngày tiêm phúc mạc trong 3
ngày và được điều trị bằng pidotimod liều 200 mg/kg.
- Lô 6 (n = 16) pidotimod sản xuất tại nước ngoài (121808-62-6) dưới dạng pha chế dung dịch uống được thử với mức liều 200 mg/kg: Chuột bị suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid liều 120 mg/kg/ngày tiêm phúc
mạc trong 3 ngày và được điều trị bằng pidotimod liều 200 mg/kg.
Thuốc thử
- Pidotimod bột nguyên liệu Việt Nam liều 200 mg/kg: Cân và pha
pidotimod trong nước muối sinh lý thành dung dịch có nồng độ 2% (kl/tt),
liều uống là 0,1 ml/10 g thể trọng.
- Pidotimod bột nguyên liệu Việt Nam liều 400 mg/kg: Cân, pha pidotimod trong nước muối sinh lý thành dung dịch có nồng độ 2,67% (kl/tt), liều uống là 0,15 ml/10 g thể trọng.
- Pidotimod sản xuất tại Việt Nam và Pidotimod 121808-62-6 (nguồn
30
+ 100ml dung dịch bao gồm: Pidotimod 2g; Natri Saccharin 0,30g; Methyl Paraben 0,19g; Propyl Paraben 0,02g; Dung dịch NaOH 0,1N vừa đủ pH 2,4. [44], [46]
- Sử dụng máy lắc Vortex để hòa tan hoàn toàn.
Thuốc gây suy giảm miễn dịch cyclophosphamid: sử dụng dạng thuốc bột pha tiêm endoxan. Pha thành dung dịch có nồng độ 1,2 % (kl/tt) trong nước muối sinh lý, tiêm phúc mạc với liều 0,1 ml/10 g thể trọng.
Tất cả thuốc thử và thuốc ức chế miễn dịch được pha theo ngày, sau khi sử dụng thuốc thừa được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh.
Dung dịch mực pelikan – 4001 tiêm tĩnh mạch: pha loãng mực theo tỷ lệ 1 ml mực : 8 ml nước muối sinh lý [28].
Dung dịch HCl 0,1N để ly giải máu: lấy 8,5 ml acid
hydrochloric đậm đặc pha với nước vừa đủ 1000 ml [1].
2.4.2. Tiến hành thí nghiệm
Mô hình thí nghiệm tiến hành theo thí nghiệm của các Biozzi và cộng sự [11] có sửa đổi cho phù hợp với điều kiện Việt Nam:
Hình 2.1. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách tiến hành:
- Theo dõi cân nặng của chuột trong suốt quá trình cho uống thuốc, để cho chuột uống đúng liều và theo dõi phản ứng bên ngoài của chuột.
13 12 5 4 3 1 Carbon (0.1 ml/10 g) tiêm tĩnh mạch CY (120 mg/kg) tiêm phúc mạc
Thời gian (ngày)
Pidotimod (200 – 400 mg/kg, p.o.), 1 lần/ngày × 12 ngày Định
31
- Ngày thứ nhất của thử nghiệm, các lô 3, 4, 5 và 6 chuột được uống pidotimod (liều 200 mg/kg và 400 mg/kg), 1 lần/ngày và uống trong 12 ngày liên tục.
- Các ngày thứ 3, thứ 4 và ngày thứ 5 tính từ khi bắt đầu cho uống
Pidotimod, các lô 2, 3, 4,5 và 6 được tiêm phúc mạc cyclophosphamid
(liều 120mg/kg/ngày) để gây suy giảm miễn dịch.
- Vào ngày thứ 13 tất cả các cá thể chuột được tiêm tĩnh mạch keo mực pelikan – 4001 (carbon) đã pha loãng với liều 0,1 ml/10 g thể trọng.
- Tại các thời điểm 0 và 15 phút sau khi tiêm mực, lấy mẫu máu từ hốc mắt ở mỗi chuột cho vào từng ống chống đông đựng riêng biệt, có
đánh dấu tương ứng; máu thu được đem đi đếm bạch cầu và đo quang.
- Xác định độ thanh thải carbon: Mỗi mẫu được thêm HCl 0,1 N để
ly giải với tỷ lệ 10µl máu/3ml HCl. Sau đó đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng trong 5 phút, loại bỏ cắn và lấy phần nước để đo quang, xác định
nồng độ carbon trong máu. Tiến hành quét phổ để xác định bước sóng tại
đó có độ hấp thụ cực đại. Ở đây, thu được bước sóng cực đại là 657 nm.
Sau đó, đo mật độ quang tại bước sóng đó (mẫu trắng là máu chuột không
tiêm mực, và tiến hành ly giải, ly tâm như các mẫu khác). - Đếm bạch cầu: Bằng máy đếm bạch cầu tự động.
- Xác định khối lượng lách và tuyến ức: Chuột sau khi lấy máu, giết
chết, mổ bụng để bộc lộ lách, tuyến ức. Bóc nhẹ nhàng cắt lấy toàn bộ tuyến ức, lách của từng con chuột, dùng gạc thấm khô nước và máu trước khi cho các tổ chức này lên đĩa cân để cân.
2.4.3. Một số chỉ tiêu đánh giá trong thí nghiệm
Sự biến đổi khối lượng chuột (SBĐTL)
KL sau điều trị - KL trước điều trị
× 100 % SBĐKL (%) =
32 Khối lượng lách tương đối (%)
Khối lượng tuyến ức tương đối (%)
Số lượng bạch cầu
Chỉ số thực bào
OD1 và OD2 là mật độ quang đo tại thời điểm T1 (0 phút) và T2 (15 phút) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tương ứng.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t – test Student. Số liệu được diễn đạt dưới dạng Xtb ± SD. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Khối lượng lách
Khối lượng lách tương đối (%) = ×100 %
Khối lượng chuột
×100 % Khối lượng tuyến ức tương đối (%) =
Khối lượng tuyến ức Khối lượng chuột
Ln OD1 – Ln OD2 K =
33
Chương 3. KẾT QUẢ
3.1. Sự biến đổi khối lượng chuột
Trong quá trình tiến hành thử nghiệm, khối lượng chuột được cân bằng cân điện tử và ghi lại để tiện theo dõi ảnh hưởng của thuốc đến khối lượng. Việc đánh giá khối lượng chuột, phần nào nói lên những tác động của
thuốc đối với cơ thể chuột theo chiều hướng tốt hơn hay xấu đi.
Kết quả sự biến đổi khối lượng chuột trước và sau khi tiêm cyclophosphamid:
Bảng 3.1. Sự biến đổi khối lượng chuột
Mã
lô Lô chuột N
Khối lượng (g) % Ngày thứ 1 Ngày thứ 3 (SD CY) Ngày thứ 13 %SBĐ 1 Chứng sinh học 16 35,75±0,98 36,25±1,08 35,69±1,18 1,6±1,04 2 Chứng bệnh lý 8 38,13±1,26 38,63±1,48 30,38±1,03 -21,17±1,48 3 Pidotimod VN liều 200mg/kg 12 36,92±2,43 37,4± 2,24 32±2,17 - 14,53±2,12 4 Pidotimod VN liều 400mg/kg 14 43,86±0,47 43 ± 0,54 37,07±0,37 - 13,68±0,95 5 Pidotimod VN dạng pha chế DD uống 13 39,85±0,88 38,54±0,79 33,31± 1,5 - 14,05±2,36 6 Pidotimod 121808-62-6 dạng pha chế DD uống 13 39,38±0,65 39,46±0,83 34,23±1,03 - 13,35±1,61
34
Hình 3.2. Khối lượng chuột
*: p < 0,05:So sánh khối lượng ngày 13 với ngày thứ 3 của chuột
Hình 3.3. Sự biến đổi khối lượng chuột
35
- Trước khi sử dụng CY để gây suy giảm miễn dịch (3 ngày đầu), khối lượng trung bình của các lô chuột tăng không đáng kể, và giữa các lô chuột khác nhau không đáng kể (p > 0,05).
- Sau khi gây suy giảm miễn dịch và tiếp tục điều trị bằng pidotimod (thời gian là 10 ngày kể từ khi bắt đầu sử dụng CY), so sánh khối lượng chuột của ngày thứ 13 và ngày thứ 3 có sự thay đổi ở toàn bộ các lô 1,3,4,5,6(P < 0,05), còn lô chứng sinh học thì hầu như không thay đổi khối lượng, điều này cho thấy tác dụng CY làm giảm khối lượng chuột rõ rệt
- Về % biến đổi khối lượng: lô chứng bệnh lý có % biến đổi khối lượng lớn nhất 21,17%. Sự biến đổi khối lượng chuột ở các lô sử dụng Pidotimod nguyên liệu Việt Nam (lô 3,4) ở 2 mức liều đều ít hơn so với lô chứng bệnh lý ở mức có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Tuy nhiên khối lượng chuột có phục hồi nhưng vẫn thấp hơn so với mức ban đầu. Sự biến đổi khối lượng chuột ở 2 lô sử dụng Pidotimod ở dạng pha chế dung dịch uống (lô 5,6) đều ít hơn so với bệnh lý ở mức có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên giữa hai lô thì sự biến đổi
khối lượng chuột gần như tương đương không có sự khác biệt mang ý nghĩa
thống kê(P > 0,05). So sánh giữa lô 3 và lô 5 thì thấy ở lô 5 sự biến đổi khối lượng chuột có giảm hơn so với lô 3 nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) điều này cho thấy trên cùng Pidotimod sản xuất ở Việt
Nam nhưng dưới dạng pha chế với nước thông thường và dưới dạng pha chế (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dung dịch uống chưa có sự khác biệt về tác dụng trên khối lượng chuột mặc dù ở dạng pha chế dung dịch uống có sự giảm khối lượng ít hơn.
3.2. Ảnh hưởng của Pidotimod lên khối lượng lách tương đối
Lách là cơ quan lympho ngoại vi, nơi trú ngụ của các tế bào lympho. Vùng tủy trắng của lách được cấu tạo chủ yếu là các mô lympho bị ảnh hưởng nhiều của các thuốc chống phân bào, gây suy giảm miễn dịch. Đánh giá khối lượng lách tương đối (so với khối lượng chuột để giảm bớt sai số
36
ảnh hưởng của pidotimod trên chuột bị suy giảm miễn dịch. Lách sau khi được bộc lộ và tách riêng, được cân bằng cân kỹ thuật có sai số là 0,01 g.
Kết quả sự khác nhau khối lượng lách tương đối giữa các nhóm chuột được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.2. Khối lượng lách tương đối
Mã lô Lô chuột N Khối lượng lách
tương đối
1 Chứng sinh học 16 0,729 ± 0,043
2 Chứng bệnh lý 8 0,465± 0,0694
3 Pidotimod VN liều 200 mg/kg 12 0,664 ± 0,0472
4 Pidotimod VN liều 400 mg/kg 14 0,683 ± 0,0534
5 Pidotimod VN dạng pha chế DD uống 13 0,696±0,102
6 Pidotimod 121808-62-6 dạng pha chế DD
uống 13 0,671 ±0,078
Hình 3.4. Khối lượng lách tương đối
*: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,01 so với lô chứng bệnh lý.
∆
37
Nhận xét:
- Cyclophosphamid làm tăng đáng kể khối lượng lách tương đối ở chuột
nhắt trắng. Khối lượng lách tương đối của lô chứng bệnh lý tăng gấp 5,7 lần so với lô chứng sinh học (p < 0,01).
- Pidotimod dạng bột nguyên liệu sản xuất Việt Nam cả 2 mức liều 400
mg/kg và 200mg/kg đều làm giảm khối lượng tương đối so với lô chứng bệnh
lý (p < 0,01), khối lượng lách tương đối ở các nhóm này cao hơn so với nhóm chứng sinh học, tuy nhiên sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Giữa hai nhóm Pidotimod Việt Nam mức liều 400 mg/kg và 200 mg/kg
khối lượng lách tương đối cũng không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê,
điều này cho thấy không có sự khác biệt về tác động lên khối lượng lách tương đối ở hai mức liều 400 mg/kg và 200 mg/kg.
- Cả hai nhóm Pidotimod Việt Nam dạng pha chế dung dịch uống và
nhóm Pidotimod 121808-62-6 dạng pha chế dung dịch uống ở mức liều 200 mg/kg đều làm giảm khối lượng tương đối so với lô chứng bệnh lý (p < 0,01). Tuy nhiên giữa hai nhóm thì tác động lên khối lượng lách tương đối không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống (P < 0,05). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- So sánh giữa lô 3 và lô 5 thì thấy ở lô 5 khối lượng lách tương đối có cao hơn so với lô 3 nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) điều này cho thấy trên cùng Pidotimod sản xuất ở Việt Nam nhưng dưới dạng pha chế thông thường và dưới dạng pha chế dung dịch uống chưa có sự khác biệt về tác dụng trên khối lượng lách tương đối mặc dù ở pha chế dung dịch uống có khối lượng cao hơn.
3.3. Ảnh hưởng của pidotimod lên khối lượng tuyến ức tương đối
Tuyến ức là một tuyến quan trọng trong hệ miễn dịch, là một cơ quan lympho trung ương, nơi huấn luyện, phân chia, biệt hóa, các tế bào lympho T. Vùng vỏ chiếm phần lớn khối lượng tuyến ức, gồm chủ yếu là các tế bào dạng lympho, một số tế bào biểu mô xen kẽ và một ít ĐTB. Do đó,
38
chịu ảnh hưởng nhiều của thuốc chống phân bào như CY. Đánh giá sự khác nhau về khối lượng tuyến ức tương đối giữa các lô chuột để xem xét một phần ảnh hưởng của các thuốc lên cấu tạo và chức năng của tuyến ức.