Có nhiều phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng điều hòa miễn dịch của một thuốc. Dựa trên các nguyên lý khác nhau, tùy thuộc vào mục
tiêu đánh giá mà sử dụng các phương pháp như đã nêu trong mục 1.2.3. Ở
đây, chúng tôi sử dụng phương pháp đo độ thanh thải carbon đánh giá
chức năng của ĐTB hệ lưới nội mô và sử dụng các chỉ số về khối lượng cơ thể, khối lượng lách tương đối, khối lượng tuyến ức tương đối và số lượng bạch cầu khảo sát tác dụng KTMD của pidotimod. Phương pháp này được sử dụng khá nhiều trên thế giới để đánh giá tác dụng trên hệ miễn dịch của nhiều thuốc. So với các phương pháp khác, phương pháp này thực hiện khá đơn giản và rẻ tiền, kết quả có độ chính xác cao.
Lựa chọn mức liều sử dụng Pidotimod để đánh giá
Pidotimod Việt Nam trong mô hình thí nghiệm được lựa chọn đánh giá với 2 mức liều 200mg/kg và 400mg/kg qua đường uống dưới dạng pha
chế trong nước đơn giản. Căn cứ trên nghiên cứu độc tính mạn của
pidotimod: ở mức liều dưới 600mg/kg đường uống thì Pidotimod không gây ra bất kì độc tính nào. Mức liều hiện tại đang sử dụng với chế phẩm
Axil là: người lớn uống 800mg/gói x 2 lần 1 ngày, trẻ em uống 400mg/lọ
x 2 lần 1 ngày. Mức liều được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá độ thanh thải carbon do G.coppi thực hiện cũng như do Biozzi thực hiện
cũng đều khảo sát ở 2 mức liều 200mg/kg và 400mg/kg qua đường uống.
Ngoài ra 1 số nghiên cứu đánh giá khả năng kích thích miễn dịch của pidotimod cũng được sử dụng với 2 mức liều trên ví dụ: đánh giá phản ứng quá mẫn muộn bằng DNCB do corsini và cộng sự thực hiện[17].
Sau khi khảo sát ở 2 mức liều 200 mg/kg và 400 mg/kg đối với dạng nguyên liệu sản xuất ở Việt Nam pha chế trong nước đơn giản thì thấy
46
không có sự khác biệt về mặt tác dụng trên khối lượng, khối lượng ức tương đối, khối lượng lách tương đối, số lượng bạch cầu và chỉ số thực bào ( p < 0,05). Vì vậy khi so sánh hai dạng bào chế dung dịch uống của Pidotimod sản xuất ở Việt Nam và Pidotimod 121808-62-6 thì chỉ cần khảo sát trên mức liều 200 mg/kg để đánh giá tác dụng trên các chỉ số như trên.
Lựa chọn CY gây suy giảm miễn dịch và mức liều sử dụng
Phần lớn các chất kích thích miễn dịch (immunostimulant) hoặc điều biến miễn dịch (immunomodulatory) không có hoặc ít có tác dụng đối với hệ miễn dịch có cấu trúc và chức năng bình thường, nó chỉ có tác dụng rõ rệt đối với hệ miễn dịch đã bị tổn thương, suy giảm hay rối loạn [4]. Do vậy, để nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod, chúng tôi sử dụng mô hình nghiên cứu tác dụng của thuốc trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng Cyclophosphamid.
Có nhiều thuốc có thể gây suy giảm miễn dịch thường được dùng trong nghiên cứu như cyclophosphamid, cycloprorin A, methotrexat, các thuốc chống viêm steroid (dexamethason, prednisolon) và yêu cầu chung đặt ra là các thuốc này phải gây suy giảm miễn dịch một cách rõ rệt so với nhóm đối chứng. Do đó, tùy vào đối tượng nghiên cứu và mục tiêu nghiên cứu để sử dụng thuốc gây suy giảm miễn dịch nào cho hợp lý. CY là nằm trong danh mục thuốc thiết yếu, được xếp vào nhóm thuốc ức chế miễn dịch, có tác dụng
alkyl hóa ADN, do đó có tác dụng ngăn chặn sự sao chép và phiên mã ADN.
CY ức chế chung sự phân chia của tất cả các tế bào đang tăng sinh, đặc biệt là các tế bào tủy xương và các tế bào biểu mô đường tiêu hóa. Vì vậy gây ra những tác dụng không mong muốn trên nhiều cơ quan và mô. CY gây giảm không chọn lọc tất cả các dòng tế bào, kể cả bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu. Số lượng bạch cầu trong máu thấp nhất thường thấy sau 10 – 12 ngày điều trị [2]. CY có chỉ số điều trị cao. LD50 của thuốc ở chuột dao động từ 370 mg/kg
47
(s.c) tới 360 mg/kg (i.p), nhanh chóng bị chuyển hóa và bài tiết trong vòng 20 – 30 phút. Sau khi tiêm phúc mạc có đến 75% được bài tiết trong vòng 5 – 8 giờ. Điều trị CY ở chuột trong thời gian dài sẽ làm thay đổi cấu trúc của một số cơ quan trong cơ thể như gan, lách, tuy,... [28]. Do vậy, CY thích hợp trong nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc lên cấu tạo, chức năng của các cơ quan lympho và các tế bào bạch cầu. Căn cứ theo các nghiên cứu đã từng thử tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod ví dụ: nghiên cứu hoạt tính không đặc hiệu trên lưới nội mô của pidotimod do Bizzi và cộng sự thực hiện sử dụng Cyclophosphamide với mức liều 120mg/kg trong 3 ngày liên tục[16], nghiên cứu đáp ứng của kháng thể với một kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức của Pidotimod do’ và cộng sự thực hiện Cyclophosphamide với mức liều 120mg/kg trong 3 ngày liên tục[17].Vì vậy trong thí nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng cyclophosphamide để gây suy giảm miễn dịch ở chuột với liều 120 mg/kg trong 3 ngày liên tiếp và kết quả là lô chứng bệnh lý có số lượng bạch cầu, khối lượng tuyến ức, lách, chỉ số thực bào giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học.
Đánh giá tác dụng không đặc hiệu trên lưới nội mô (phương pháp đo độ thanh thải carbon).
Sau khi nghiên cứu một số báo cáo thử tác dụng trên hệ miễn dịch của các thuốc khác nhau về phương pháp này [11], [17], [19], [28], [35], chúng tôi đã sử dụng cyclophosphamid làm chất gây suy giảm miễn dịch, sử dụng mực pelikan – 4001 để làm kháng nguyên ngoại lai, sử dụng
phương pháp đo quang tại bước sóng ánh sáng đỏ để xác định nồng độ
carbon và tiến hành đánh giá trên chỉ số thực bào.
Các ĐTB, tùy vào hình thái, tính chất và nơi trú ngụ mà có tên gọi khác
nhau: tế bào Langerhans (da), Kuffer (gan), ĐTB phế nang (phổi)… Hệ thống các tế bào này còn được gọi là hệ thống lưới nội mô. Để đánh giá chức năng của hệ thống lưới nội mô, chúng tôi sử dụng chỉ số thực bào (phagocytic
48
index) được tính thông qua độ thanh thải carbon (carbon clearance test) theo
nghiên cứu của Biozzi và cộng sự [11]. Một số tiêu chí trong việc lựa chọn chất dùng để nghiên cứu hoạt động của các tế bào RES:
- Các hạt phải được thực bào bởi các tếbào RES và không tương tác với các tế bào khác.
- Không đi qua được hàng rào mao mạch.
- Đồng nhất về kích thước.
- Không độc hại cho cơ thể và các tế bào RES.
- Ổn định in vitro và in vivo.
- Được đo chính xác [27].
Vì vậy chúng tôi sử dụng mực pelikan – 4001(Đức) thay cho việc sử dụng mực Tàu như trong nghiên cứu của Coppi G. và cộng sự [17]. So với mực Tàu thì mực pelikan có thành phần và chất lượng đảm bảo chuẩn hơn, thành phần chính là carbon là một chất trơ, không có các thành phần khác gây đáp ứng sinh học. Các phần tử carbon có kích thước mịn (khoảng 250 Å), đồng đều, tạo dạng hỗn dịch đồng nhất, không gây lắng cặn [11].
Phương pháp đo quang là phương pháp khá dễ thực hiện và tương đối
chính xác trong việc xác định nồng độ của một chất trong dung dịch. Đối với nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành ly giải các tế bào bằng HCl để giải phóng các hạt carbon nằm trong các tế bào khác ngoài hệ thống lưới nội mô, sau đó ly tâm để loại bỏ xác tế bào, thu được dung dịch trong suốt, không ảnh hưởng đến độ hấp thụ của carbon và tiến hành quét phổ (sử dụng mẫu trắng là mẫu máu chuột không tiêm mực tại 2 thời điểm 0 và 15
phút) để tìm bước sóng có độ hấp thụ cực đại của carbon và thu được λmax
= 657 nm ở ánh sáng đỏ, phù hợp với các nghiên cứu trước đó cũng sử dụng carbon clearance test để tính chỉ số thực bào.
49
Đánh giá tác dụng kích thích miễn dịch của pidotimod trên các chỉ số khối lượng, khối lượng tương đối tuyến ức, lách và số lượng bạch cầu.
Khi tiến hành đánh giá tác dụng kích thích miễn dịch của pidotimod, chúng tôi sử dụng các chỉ số về khối lượng chuột, khối lượng tương đối của các cơ quan lympho, số lượng bạch cầu và chỉ số thực bào. Các chỉ số này đều liên quan đến khả năng miễn dịch của cơ thể. Khối lượng cơ thể,
khối lượng tương đối của các cơ quan lympho, số lượng bạch cầu cho một
cái nhìn tổng quan về khả năng ĐƯMD chung của con vật khi bị gây suy giảm miễn dịch trước các tác động bên ngoài. Chỉ số thực bào đặc trưng cho chức năng và hoạt động của ĐTB trong hệ thống lưới nội mô. Vì vậy khi đánh giá các chỉ tiêu này trên con vật có thể kết luận sơ bộ khả năng kích thích miễn dịch của Pidotimod.