Xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người việt nam để đối phó chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và ung thư

MỞ ĐẦU Hiện nay, các nghiên cứu về y sinh học hiện đại, triển khai các kỹ thuật proteomics trong tìm kiếm các biomarker có khả năng ứng dụng trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị các bệnh nan y đang là mối quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam. Biomarker không đòi hỏi các bước nghiên cứu nhiều thử thách như trong truy tìm gen liên quan đến bệnh lý, hay như việc tạo những sản phẩm protein trị liệu, vaccine thường đòi hỏi kỹ thuật cao, công phu và tốn kém. Trang bị chính của nghiên cứu biomarker là các thiết bị phân tách, làm sạch và nhận dạng, xác định các proteinproteome (hệ máy khối phổ phân giải cao cộng với khả năng sử dụng những chương trình điện toán về proteomics) hiện đã được thiết lập ở một số cơ sở nghiên cứu. Hơn nữa, chúng ta có những lợi điểm không chỉ về số lượng mẫu phẩm dồi dào của các loại bệnh, mà còn dồi dào các dữ kiện lâm sàng trong việc đánh giá khả năng ứng dụng các biomarker trong trị liệu. Đây là những yếu tố cần thiết cho thống kê để thu đựơc những biomarker có độ chính xác cao qua việc xác định cũng như loại trừ các protein trong nhóm biomarker. Điểm đặc biệt nữa là giá trị đặc thù của biomarker có thể có liên quan đến “dấu ấn” sinh học của chủng tộc. Các dấu ấn này cũng sẽ là chủ đề quan trọng cho những nghiên cứu y học từ nguyên nhân bệnh lý cho đến tác động môi trường, cũng như dược học trong việc tìm kiếm hay thẩm định tính trị liệu của các dược phẩm ở Việt Nam. Với những kỹ thuật và các kết quả bước đầu thu nhận được trong thời gian vừa qua của các cán bộ Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong nghiên cứu hệ protein huyết thanh người Việt Nam bằng các kĩ thuật proteomics có thể được coi là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về mối quan hệ giữa các marker protein liên kết với một số bệnh lý trong chẩn đoán lâm sàng. Đó cũng chính là mục đích của các nghiên cứu về hệ protein người nói chung và hệ protein huyết thanh người nói riêng, là tìm hiểu bức tranh tổng thể của các protein được biểu hiện, có thêm hiểu biết về các biến đổi của hệ protein trong các trạng thái bệnh lý và khả năng khai thác, sử dụng những thay đổi này như các công cụ chẩn đoán hoặc điều trị các bệnh cho con người. Trên cơ sở những trang thiết bị khá đồng bộ và hiện đại về proteomics được đầu tư theo Dự án “Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen” tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện KHCN Việt Nam và những kết quả nghiên cứu bước đầu về xác lập các phương pháp phân tích proteinproteome, tìm kiếm các chỉ thị protein trong huyết thanh người trong thời gian qua, chúng tôi đã được phê duyệt đề tài “Xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanhngười Việt Nam để phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia” giai đoạn 20082010 với mục đích nghiên cứu có hệ thống hệ protein huyết thanh người Việt Nam ở trạng thái bình thường và các trạng thái bệnh ĐTĐT2, leukemia, tìm những protein có biến đổi đặc trưng cho các trạng thái bệnh có thể phát triển thành các chỉ thị chẩn đoán bệnh. Mục tiêu của đề tài Phân tích, xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam bình thường và một số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2, leukemia, .) bằng các kỹ thuật proteomics và bioinformatics; Nhận dạng và xác định các ứng viên chỉ thị protein có biến đổi về cấu trúc và chức năng liên quan đến sự phát sinh và phát triển của bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia ở Việt Nam; Nghiên cứu khả năng ứng dụng các chỉ thị protein trong phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia. Nội dung chính của đề tài Phân tích, xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam bình thường và một số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2 và leukemia ) bằng các kỹ thuật proteomics và bioinformatics Phân tích, nhận dạng và xác định các ứng viên chỉ thị protein (protein markers candidates) đối với bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia Thử nghiệm ứng dụng các ứng viên chỉ thị protein trong chẩn đoán

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI XÂY DỰNG NGÂN HÀNG DỮ LIỆU HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI VIỆT NAM ĐỂ ĐỐI PHÓ CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 VÀ UNG THƯ CNĐT: PHAN VĂN CHI 8315 HÀ NỘI – 2011 1 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU Hiện nay, các nghiên cứu về y sinh học hiện đại, triển khai các kỹ thuật proteomics trong tìm kiếm các biomarker có khả năng ứng dụng trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị các bệnh nan y đang là mối quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam. Biomarker không đòi hỏi các bước nghiên cứu nhiều thử thách như trong truy tìm gen liên quan đến bệnh lý, hay như việc tạo những sản phẩm protein trị liệu, vaccine thường đòi h ỏi kỹ thuật cao, công phu và tốn kém. Trang bị chính của nghiên cứu biomarker là các thiết bị phân tách, làm sạch và nhận dạng, xác định các protein/proteome (hệ máy khối phổ phân giải cao cộng với khả năng sử dụng những chương trình điện toán về proteomics) hiện đã được thiết lập ở một số cơ sở nghiên cứu. Hơn nữa, chúng ta có những lợi điểm không chỉ về số lượ ng mẫu phẩm dồi dào của các loại bệnh, mà còn dồi dào các dữ kiện lâm sàng trong việc đánh giá khả năng ứng dụng các biomarker trong trị liệu. Đây là những yếu tố cần thiết cho thống kê để thu đựơc những biomarker có độ chính xác cao qua việc xác định cũng như loại trừ các protein trong nhóm biomarker. Điểm đặc biệt nữa là giá trị đặc thù của biomarker có thể có liên quan đến “dấu ấn” sinh học của ch ủng tộc. Các dấu ấn này cũng sẽ là chủ đề quan trọng cho những nghiên cứu y học từ nguyên nhân bệnh lý cho đến tác động môi trường, cũng như dược học trong việc tìm kiếm hay thẩm định tính trị liệu của các dược phẩm ở Việt Nam. Với những kỹ thuật và các kết quả bước đầu thu nhận được trong thời gian vừa qua của các cán bộ Viện Công nghệ sinh họ c, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong nghiên cứu hệ protein huyết thanh người Việt Nam bằng các kĩ thuật proteomics có thể được coi là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về mối quan hệ giữa các marker protein liên kết với một số bệnh lý trong chẩn đoán lâm sàng. Đó cũng chính là mục đích của các nghiên cứu về hệ protein người nói chung và hệ protein huyết thanh người nói riêng, là tìm hiểu bức tranh tổng thể của các protein được biể u hiện, có thêm hiểu biết về các biến đổi của hệ protein trong các trạng thái bệnh lý và khả năng khai thác, sử dụng những thay đổi này như các công cụ chẩn đoán hoặc điều trị các bệnh cho con người. Trên cơ sở những trang thiết bị khá đồng bộ và hiện đại về proteomics được đầu tư theo Dự án “Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen” tại Viện Công nghệ Sinh học, Vi ện KH&CN Việt Nam và những kết quả nghiên cứu bước đầu về xác lập các phương pháp phân tích protein/proteome, tìm kiếm các chỉ thị protein trong huyết thanh người trong thời gian qua, chúng tôi đã được phê duyệt đề tài “Xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam để phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia” giai đoạn 2008-2010 với mục đích nghiên cứu có hệ thống hệ protein huyết thanh người Việ t Nam ở trạng thái bình thường và các trạng thái bệnh ĐTĐT2, leukemia, tìm những protein có biến đổi đặc trưng cho các trạng thái bệnh có thể phát triển thành các chỉ thị chẩn đoán bệnh. 2 Mục tiêu của đề tài 9 Phân tích, xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam bình thường và một số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2, leukemia, ) bằng các kỹ thuật proteomics và bioinformatics; 9 Nhận dạng và xác định các ứng viên chỉ thị protein có biến đổi về cấu trúc và chức năng liên quan đến sự phát sinh và phát triển của bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia ở Việt Nam; 9 Nghiên cứu khả năng ứng dụng các chỉ th ị protein trong phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia. Nội dung chính của đề tài 9 Phân tích, xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam bình thường và một số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2 và leukemia…) bằng các kỹ thuật proteomics và bioinformatics 9 Phân tích, nhận dạng và xác định các ứng viên chỉ thị protein (protein markers candidates) đối với bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia 9 Thử nghiệm ứng dụng các ứng viên chỉ thị protein trong chẩn đoán 3 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tại sao phải nghiên cứu hệ protein (proteome)? Thách thức chính hiện nay đối với những nhà sinh vật học là sử dụng sự phong phú về thông tin di truyền sẵn có từ chương trình xác định trình tự gen không phải chỉ để giải mã trình tự các acid amin của những protein được mã hóa mà còn là xác định những chức năng của chúng. Có rất nhiều nhân tố có ảnh hưởng đến gen, sự biểu hiện của protein và cả trực tiếp đến protein. Vì thông tin giữa gen và protein là hai chiều, kiểu hình (phenotype) của t ế bào bị ảnh hưởng bởi những tương tác giữa các quá trình chuyển hoá được điều chỉnh một cách thống nhất bên trong tế bào. Protein là đầu ra về chức năng của tế bào và do đó có thể cho biết những thông tin thích đáng nhất, đặc biệt khi giải thích về sự biểu hiện của chúng có tính đến động học trong ngữ cảnh của các quá trình hóa sinh đặc biệt. Sự biểu hiện hoặ c chức năng của protein được điều hoà ở tại nhiều thời điểm, từ phiên mã đến dịch mã và sau dịch mã. Các quá trình này, nói chung đều không thể dự đoán được từ kết quả phân tích trình tự gen. Sau dịch mã, đa phần các phân tử protein lại bị biến đổi hoá học bởi các tương tác protein-protein hay các phản ứng với các nhóm carbohydrate, phosphate Chính những biến đổi này (post-translational modifications, PTMs) đóng vai trò chủ yếu trong kích hoạt chức n ăng của nhiều protein chứ không phải được mã hoá trực tiếp từ gen. Kết quả là từ một gen ban đầu ta có thể tìm thấy sự đa dạng về biểu hiện, cấu trúc và chức năng của rất nhiều loại protein khác nhau. Ở các cơ thể khác nhau, mức độ đa dạng này cũng khác nhau. Những nghiên cứu sơ bộ cho thấy, từ một gen có thể phát sinh từ một tới hai protein trong vi khuẩ n, ba trong nấm men, và tới hơn sáu ở người (Wilkins MR et al, 1996; Banks RE et al, 2000; Tyers M and Mann M, 2003). Trên cơ sở số gen đã phát hiện và các khả năng biến đổi sau dịch mã, người ta cũng đã ước tính trong cơ thể người có tới một triệu protein cần được nghiên cứu (Banks RE et al, 2000; Jensen ON, 2004). Từ sự phân tích trên ta có thể thấy, mặc dù proteome là bổ trợ của genome, đây vẫn là hai khái niệm khác nhau cả về không gian và thời gian. Khi trình tự của gen không thể cho biế t các thông tin về các biến đổi sau phiên mã có ảnh hưởng và quyết định đến chức năng và hoạt tính của protein thì mức độ biểu hiện gen không thể phản ánh đúng về số lượng protein có hoạt tính trong tế bào. Thực ra cũng chỉ có khoảng 2% số bệnh tật đã biết được xác định là do có các sai lệch về trình tự gen, hay còn được coi là monogenic (Strohman R, 1994); 98 % số bệnh còn lại cần được làm sáng tỏ ở mức tương tác gi ữa các protein, hay còn gọi là mạng protein (protein network) (Ideker T et al, 2008 ). Bài toán đặc biệt quan trọng này của proteomics sẽ bao gồm cả việc xác định các PTMs và vai trò của chúng trong các quá trình điều hoà và t- ương tác protein-protein. Nghiên cứu về proteome chính là nghiên cứu trực tiếp về chức năng của genome, và do đó có thể trả lời được các câu hỏi sau: (i) phần nào của genome đư- ợc biểu hiện; (ii) ở đâu, khi nào và có bao nhiêu sản phẩm được biểu hiện; (iii) các sản phẩm protein bị biế n đổi như thế nào và (iv) các sản phẩm có những tương tác gì và kết quả của những tương tác này là gì. Bộ gen là tập hợp các thông tin mã hoá và chỉ dẫn cho quá trình tạo ra các protein, còn proteome thì phức tạp hơn nhiều. Dựa trên sự phân loại các vùng (domain) có liên quan đến các chức năng của các protein, Venter và các cộng sự 4 (Venter JC et al, 2001) đã tiến hành dự đoán và phân chia tỷ lệ của các sản phẩm protein có thể có từ hệ gen người (Nanni L et al, 2010). Cho đến nay chưa có thể xác định chính xác liệu có bao nhiêu loại protein có thể có trong mỗi tế bào người. Những công bố gần đây nhất cho thấy, đã có thể xác định và chú giải cho 21 037 trình tự protein từ bộ gen người (Imanishi T et al, 2004). Cùng với sự phát triển của các kỹ thuật proteomics, ngày càng có thêm nhiề u các loại protein được nhận dạng và xác định, bổ trợ cho các trình tự đã công bố của bộ gen. Ví dụ, trong huyết thanh người, nếu như năm 2002 chỉ mới phát hiện được 490 loại protein khác nhau (Adkins JN et al, 2002) thì những công bố năm 2004 cho thấy con số này đã là 1.444 (Chan KH et al, 2004) và gần đây nhất, năm 2005, theo kết quả xác định và so sánh của 35 phòng thí nghiệm trong dự án proteome huyết tương người của HUPO, con số này đã có thể là 3.020 (Omenn GS et al, 2005). Lượng thông tin phong phú do các nghiên cứu về proteome đem lại hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ những nghiên cứu về genome. Proteomics sẽ là cơ sở cho sự phát triển của genomics chức năng. Sự phối hợp giữa genomics, proteomics và bioinformatics sẽ đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh-y học, là nền tảng cho sự phát triển các sản phẩm chẩn đoán và chữa bệnh trong tương lai. Chỉ ngoại trừ một số bệnh di truyền, mà gen đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán, phần lớn các bệnh mãn tính như ung thư, tim mạch, đái tháo đường đều liên quan đến mức độ biểu hiện, hoạt động và tương tác giữa các protein (Kristine AP et al, 2009). Như vậy, dấu ấn sinh học (biomarker) hay còn được gọi là “chữ ký” (signature) trong các trường hợp này chính là những chỉ thị protein, những phân tử không chỉ mang bí ẩn về các quá trình bệnh lý, mà còn có thể mang tính đặ c thù, liên quan tới nhiều yếu tố, bao gồm cả vấn đề chủng tộc và sinh thái. Việc truy tìm các chữ ký sinh học này sẽ giúp đạt được những kết quả có tầm ứng dụng hữu hiệu và lớn lao trong y học. Nghiên cứu biomarkers sẽ giúp tạo được những mô hình phân tử về bệnh lý có khả năng khảo sát được bằng những thí nghiệm cụ thể, qua đó có thể xác định được vai trò của gen và s ản phẩm của nó cho chẩn đoán và trị liệu. Theo xu hướng phát triển của các bộ môn Genomics, Proteomics và Bioinformatics, hiện đã có một mạng lưới liên kết các phòng thí nghiệm nhằm tiến đến tạo dựng một kho dữ liệu (consortium) các biomarker cho các bệnh lý và các đề tài sinh học khác (http://www.innovation.org/index.cfm/NewsCenter/Briefings/The_Biomarkers_Consortium ). Trên cơ sở đánh giá tình hình nghiên cứu, phân tích những công trình nghiên cứu có liên quan có thể thấy, proteomics thật sự đã làm thay đổi rất nhiều trong sinh học và các ngành liên quan. Nhờ có các khái niệm mớ i về proteomics, sự sống của các phiên bản genome tĩnh lặng đã thật sự trở thành những proteome năng động. Việc nghiên cứu proteome-tập hợp các protein được biểu hiện bổ trợ của hệ gen và cũng là của một mô hay một kiểu tế bào, sẽ giúp thu được những thông tin bổ sung hữu ích cho những kiến thức mới hỗ trợ cho những nghiên cứu chẩn đoán và lâm sàng. Đây cũng chính là cách ti ếp cận để tìm kiếm các biomarkers, “chữ ký” hay còn được coi là một nhóm gene hay protein của một hiện tượng/dữ kiện sinh học. Biomarker đã là một trong những nghiên cứu trọng yếu của sinh 5 học hiện đại trong những năm qua, và đã có những kết quả cho thấy tầm quan trọng và tương quan lớn lao của biomarker trong rất nhiều ngành của bộ môn Sinh-Y- Dược học. Từ các công trình nghiên cứu biomarker ở nhiều trung tâm nghiên cứu, đã có những thành quả hứa hẹn những ứng dụng rất tốt đẹp của biomarker cho việc chẩn đoán bệnh và trị liệụ. Việc ứng dụng biomarker để hoàn chỉnh hoặc thay thế các thử nghiệm thường quy sẽ chỉ còn là vấn đề thời gian. Những biomarker này nhằm giúp tiên đoán sớm và chính xác các trường hợp bệnh lý từ ung thư đến tim mạch, đái tháo đường…; biomarker còn có giá trị tiên đoán hiệu ứng của thuốc để giúp các chuyên gia y tế lấy quyết định đúng đắn nhất cho việc điều trị bệnh nhân. Đi xa hơn nữa, biomarker có tiềm năng trong ứng dụng liệu pháp trị liệu cá nhân (personalized medicine). Như đã nêu trên, nền tảng của nghiên cứu biomarker dựa trên các protein, vì thế vai trò của nghiên cứu proteomics là thiết yếu. Tuy nhiên, số lượng lớn lao (dự đoán khoảng có từ 300.000 đến 500.000 protein), và đặc biệt là bản chất phức tạp của protein là một trở ngại lớn cho các nghiên cứu biomarker. Theo các tài liệu nghiên cứu, hiện đã có khoảng gần 1500 ứng viên proteins được coi là có liên quan đến ung thư và đươ ng nhiên là việc tiêu chuẩn hóa các protein này là cần thiết để chọn lọc những protein thực sự có gía trị ứng dụng. Hơn nữa, thực tế đòi hỏi phải có những thử nghiệm lâm sàng chi tiết và cũng có thể dài hạn, trước khi triển khai các biomarker thành sản phẩm có giá trị trong cộng đồng xã hội (Polanski M, Anderson NL, 2006; Austin MJF, Babiss L, 2006). Huyết thanh là một hệ protein đặc biệt trong chẩn đoán bệnh, cách tiếp cận Sự hấp dẫn của huyết thanh đối với việc chẩn đoán bệnh được quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu không chỉ phản ánh toàn diện phenotype người, mà còn cho biết trạng thái của cơ thể ở tại một thời điểm đặc biệt nào. Có thể phân các protein trong huyết thanh thành các nhóm: (1) Các protein được tiết ra từ các mô. Đó là các protein phần lớn đượ c tiết ra từ gan, ruột và có khối lượng phân tử lớn hơn 45 kDa, lớn hơn kích thước các phân tử có thể lọc qua thận. Chính vì vậy, chúng có thể kéo dài thời gian lưu hành trong huyết thanh; (2) Các globulin miễn dịch. Đó là các kháng thể hoạt động chủ yếu trong huyết tương, đại diện cho một lớp protein phức tạp nhất. Đã có những ước tính cho rằng phải có tới hàng triệu trình tự của các kháng thể khác nhau lưu hành trong h ệ tuần hoàn của một người trưởng thành (Anderson NL, & Anderson NG, 2002); (3) Liên kết thụ cảm “khoảng cách xa”. Trong nhóm protein này gồm các peptide ”cổ điển” và những protein hormone (ví dụ như insulin, erythropoietin ; (4) Liên kết thụ cảm “địa phư- ơng”. Loại này bao gồm các cytokine và những tác nhân điều hòa ở khoảng cách ngắn. Đây thường là các peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, dễ dàng bị lọc qua thận. Bởi vậy, chúng chỉ lưu hành trong thời gian ngắ n ở huyết tương và có vẻ như được thiết kế để làm trung gian cho tương tác giữa các tế bào, sau đó được hoà loãng vào trong huyết tương; (5) Các “hành khách” tạm thời. Đó là những protein không phải hormone, tạm thời lưu thông trong huyết tương trên đường chuyển động tới vị trí hoạt động của chúng. Ví dụ, các protein từ lysosome được tiết ra và sau đó qua một hệ thụ cảm (receptor) được tập hợp trong những th ể tiêu bào; (6) Các sản phẩm phát sinh từ các mô. Đó là những protein hoạt động bình 6 thường ở các tế bào/mô, nhưng có thể được giải phóng vào huyết tương sau khi các tế bào bị chết hoặc bị tổn thương. Các protein này bao gồm nhiều loại marker quan trọng như troponin, creatine kinase, hoặc myoglobin (đang được sử dụng trong chẩn đoán bệnh nhồi máu cơ tim); (7) Các protein tiết ra do bị lỗi. Những protein này được giải phóng từ những khối u hoặc mô bị bệnh. Đó có thể là những marker ung th ư mà cũng có thể là những protein bình thường, được các tế bào khối u biểu hiện, tiết ra, hoặc được giải phóng vào trong huyết tương; (8) Các protein ngoại lai. Đó là những protein của những cơ thể lây nhiễm (vi sinh vật) hoặc các ký sinh được giải phóng và lưu hành trong hệ tuần hoàn. Sự hiện diện của những lớp protein kể trên cho thấy sự đa dạng rất đáng ngạc nhiên của hệ proteome huyế t thanh. Câu hỏi là: có bao nhiêu protein có mặt trong huyết thanh? Nếu tính rằng mỗi loại protein huyết thanh lại có chừng 10 đến 20 dạng glycosyl hoá với khoảng 5 kích thước khác nhau, thì tổng số sẽ phải có ít nhất khoảng 50 000 dạng phân tử protein khác nhau. Ngoài ra, phải kể đến một nhóm khá lớn các protein được hình thành và tiết từ các mô trên cơ sở số gen đã được xác định trong bộ gen người (25 000 – 30 000) và số sản phẩm protein có thể được phát sinh từ mỗi gen (khoảng 10 protein/gen). Như vậy, về mặt nguyên lý, huyết thanh là một proteome khá toàn diện và cũng là phiên bản lớn nhất. Sử dụng huyết thanh trong chẩn đoán bệnh là một cách tiếp cận hiển nhiên, được tiến hành thành công trong mấy thập niên qua (Burtis CA & Ashwood ER, 1999; Lembo AJ et al, 2009; Magni F et al, 2010). Tuy nhiên, tiềm năng của cách tiếp cận ”trực tiếp” này không phải lúc nào cũng dễ được xác định. Thách thức lớn nhất trong nghiên cứu proteome huyết thanh người không chỉ ở số l ượng quá lớn các protein (>10 000 loại) có mặt trong đó, mà còn là tỷ lệ về hàm lượng quá chênh lệch của chúng (10 12 ). Chỉ một nhóm nhỏ các protein như albumin, alpha2-macroglobulin, transferin và immunoglobulin đã chiếm tới hơn 80 % lượng protein tổng số của huyết thanh gây trở ngại cho việc ứng dụng kỹ thuật 2-DE truyền thống (Tirumalai RS et al., 2003; Zhang R et al, 2004, Sarker M, Hanumanthu G & Pandey A, 2007). Để có thể tiến hành những phân tích hữu hiệu, thông thường những protein có nồng độ quá cao thường phải được loại bỏ, nhưng khi thực hiện kỹ thuật này hàng loạt các protein quan trọng có nồng độ thấp (ví dụ, cytokine) cũng có thể bị loại mất theo. Những công bố gần đây đã cho thấy, số lượng các protein phân tích được bằng phương pháp khối phổ cũng phụ thuộc rất nhiều vào các kỹ thuật xử lý và tách chiết ban đầu đối với các mẫu huyết thanh (Anderson NL & Anderson NG, 2002; Adkins JN et al, 2002; Celis JE et al, 2004; Tirumalai RS et al, 2003; Diamandis EP, 2007). Cũng vì các lý do kể trên, việc chọn và kết hợp sử dụng hợp lý các ph ương pháp, đặc biệt là các phương pháp có độ nhạy và chính xác cao như sắc ký lỏng đa chiều (MDLC) và điện di trên gel kết hợp với các hệ khối phổ liên tiếp (MALDI và ESI-MS/MS) có độ nhạy và phân giải cao, có thể tự động phân tách, nhận diện và xác định tổng thể, bao gồm cả những protein/peptide ở nồng độ thấp (fmol) dựa trên các Ngân hàng dữ liệu Gen và Protein NCBInr và MSDB là hết sức quan trọng trong phân tích và tìm kiếm các marker chẩn đoán trong huyết thanh. M ột điểm đáng chú ý là khi nghiên cứu hệ protein huyết thanh bằng hệ LC-MS/MS cho thấy khả năng phân tích và nhận diện khá toàn diện không chỉ về thành phần, mà còn những biến đổi có thể về cấu trúc và tương tác của nhiều loại protein. Cũng chính vì vậy, những nghiên cứu với các cách tiếp cận tương tự có thể giúp tìm kiếm những protein marker đích thực cho việc giải 7 thích các cơ chế bệnh sinh, chẩn đoán và đánh giá tác động của thuốc. Sử dụng cách tiếp cận và các phương pháp như mô tả trên sẽ cho phép thấy được bức tranh về tương tác của cả tập hợp các chỉ thị protein có nguồn gốc từ các các mô khác nhau, có liên quan đến quá trình phát sinh và phát triển của bệnh lý, đề xuất phương pháp chẩn đoán đúng, loại trừ những sai sót do chỉ dựa trên những chỉ thị đơn lẻ (Diamandis EP, 2004; Hortin GL et al, 2006; Horin GL, 2007). Đây cũng là một trong những nội dung và mục đích nghiên cứu chính của Dự án Proteome Huyết tương Người (Human Plasma Proteome Project) hiện được coi là một trong những dự án quan trọng nhất của Tổ chức Nghiên cứu Proteome Người (Human Proteome Organization, HUPO, http://www.hupo.org; và Asia and Oceania Human Proteome Organization, AOHUPO, http://www.aohupo.org) với sự tham gia của hàng chục phòng thí nghiệm proteomics hàng đầu trên thế giới. Cũng cần phải nói thêm, mặc dù HUPO mới chỉ hoạt đông từ 2001, như ng đã đạt được nhiều thành tựu trong phối hợp giữa các thành phần nhà nước và tư nhân, đã nỗ lực tạo dựng sự hợp tác có hiệu quả của một thế hệ mới các nhà khoa học nghiên cứu proteomics, xây dựng nền tảng vững chắc về proteomics, mang lại trật tự mới trong nghiên cứu hệ protein trong tế bào, thúc đẩy những nghiên cứu và sự phát triển của liên ngành Sinh-Y-Dược học. Nế u các hội nghị quốc tế HUPO thường niên lần 1-3 (Versailles 2002, Montreal 2003, Bejing 2004) chỉ chủ yếu giới thiệu các kết quả về giải mã hệ gen, thì hội nghị HUPO lần 4 (Munich 2005) đã tập trung chủ yếu vào chức năng của hệ gen (From Defining the Proteome to Understanding Function), còn tiêu đề của hội nghị HUPO lần 5 (California 2006) đã là áp dụng những nghiên cứu từ phòng thí nghiệm phục vụ người bệnh (Translating Proteomics from Bench to Bedside), và từ hội nghị HUPO lần 6 (Seoul 2007) là phát triển công ngh ệ và ứng dụng các biomarkers (Proteomics: from Technology Development to Biomarkers Applications). Nghiên cứu proteomics đối với đái tháo đường type 2 Mặc dù, cơ chế phân tử của sự phát triển bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và các biến chứng của chúng đã được nghiên cứu nhiều, những hiểu biết để phát hiện giai đoạn sớm của ĐTĐ còn hạn chế. Việc triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử đã mở ra một hướng mới để tìm hiểu quá trình phát triển bệnh cũng như chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm. Bằng cách sử dụng các kỹ thuật genomic các nhà khoa học đã tìm ra một số gen được coi lá có liên quan đến bệnh ĐTĐ type 2 như: PPARγ (Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ) (Yael R et al, 2010), IRS-1 (insulin receptor substrate 1) (Bishop JR et al, 2010), KCJN11 (potassium inward rectifier 6.2) ( Winkler M et al, 2009), SLC2A1 (glucose transporter 1), PPARGC-1 (PPARγ -coactivator-1) (Joly E et al, 2009) và CAPN10 (calpain 10), TCFL2 (transcription factor 7-like 2) (Chauhan G et al, 2010; Dennis T et al, 2010). Năm 2005, một tổ chức nghiên cứu ĐTĐ ở Madras khi nghiên cứu đa hình gen k121Q nhận thấy chúng có vai trò quan trọng với sự phát triển của bệnh ĐTĐ type 2 ở các tộc người châu Âu và Á (Abate N et al, 2005). Mohan và cộng sự khi nghiên cứu trên nhóm người Ấn Độ và Châu Âu cũng đã tìm thấy sự liên quan của đa hình alen A Thr394Thr (G-A) ở gen PCG-1 với ĐTĐ type 2 (Vimaleswaran KS et al , 2005). Ngoài ra, khi nghiên cứu mức độ biểu hiện của các gen ở các bệnh nhân ĐTĐ type 2, Rao cùng cộng sự đã chỉ ra gen PBCs biểu hiện tăng trong máu của các bệnh nhân này, đồng thời ông cũng cho thấy mức độ biểu hiện gen lipoprotein 8 lipase (LPL) và Apolipoprotein C – III (APOC III) có sự khác nhau ở những người bị ĐTĐ type 2 và hội chứng tăng lipid (Rao PV et al, 2005). Những nghiên cứu này mở ra triển vọng cho các nhà khoa học trong việc kiểm tra cơ chế gây bệnh và khả năng chỉ thị của các gen này trong việc chẩn đoán bệnh ĐTĐ type 2. Với sự phát triển của các kỹ thuật proteomic, những biểu hiện của ĐTĐ type 2 cũng được nghiên cứu ở mức độ protein (Hongfang L et al, 2010). Ngay từ năm 1996, Rema cùng cộng sự cho thấy mức độ biểu hiện của haptoglobulin huyết thanh tăng lên ở các bệnh nhân ĐTĐ type 2 so với mẫu đối chứng (Rema M, Mohan V, Snehalatha C, 1996). Năm 2004, Zhang và cộng sự bằng cách sử dụng 2DE kết hợp khối phổ đã chỉ ra mức độ biểu hiện của các protein như haptoglobulin, complement component 3, complement component 4, alpha2-HS glycoprotein, Alpha-1B-glycoprotein, Alpha-1-antichymotrypsin, Apolipoprotein-AI, Apolipoprotein B100, Factor H, Pro-platelet basic protein, Serine (hoặc cysteine) proteinase Inhibitor clade A, Serine (hoặc cysteine) proteinase Inhibitor clade C, Vitronectin precursor, Fibronectin, C1 inhibitor, Alpha-2 macroglobulin có sự thay đổi ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 (Zhang R et al, 2004). Khi nghiên cứu hệ protein của nước tiểu bằng cách sử dụng các phương pháp proteomic, Jain và cs đã tìm thấy sự biểu hiện đặc biệt của 4 protein, chỉ thị của ĐTĐ type 2: zinc alpha-2 glycoprotein, alpha-1 acid glycoprotein, alpha-1 microglobulin và IgG (Jain S et al, 2005) và năm 2009, Jiang H cùng cộng sự đã chứng minh rằng protein E-cadherin trong nước tiểu cũng được coi là chỉ thị cho ĐTĐT2 (Jiang H et al, 2009). Nghiên cứu gần đây nhấ t của một nhóm các nhà khoa học người Ấn Độ trên hệ proteome nước tiểu cho thấy khi so sánh mức độ biểu hiện của protein nước tiểu ở các bệnh nhân ĐTĐ bệnh thận so với ĐTĐ không mắc bênh thận bằng 2 DE đã chỉ ra 7 protein có mức độ biểu hiện tăng lên hơn 1,5 lần ở: 1B -Glycoprotein tăng 7 lần, zinc- 2 -glycoprotein (5.9 lần), 2 -HS-glycoprotein (4.7 lần), vitamin D–binding protein (VDBP) (4.8 lần), calgranulin B (3.9 lần), 1 -antitrypsin (A1AT) (2.9 lần), và hemopexin (2.4 lần ). Đặc biệt so sánh với các mẫu đối chứng người ta còn nhận thấy VDBP tăng 11.1 lần, zinc- 2 - glycoprotein (6.0 lần), 2 -HS-glycoprotein precursor (2.3 lần), và A1AT (2.2 lần). Và 4 protein có mức độ biểu hiện giảm dưới 1.5 lần ở các bệnh nhân ĐTĐ bệnh thận so với ĐTĐ không mắc bệnh thận là Transthyretin giảm 4.3 lần, apolipoprotein (apo) A-I (3.2 lần), 1 - microglobulin/bikunin precursor (AMBP) (1.61 lần), và plasma retinol-binding protein (1.52 lần). So sánh với các mẫu đối chứng thì mức độ giảm của các protein này càng rõ rệt hơn: AMBP giảm 5.06 lần, retinol-binding protein (2.56 lần) và apoA-I (2.53 lần) (Rao PV et al, 2007). Xinghai Li cùng cộng sự cũng đã chỉ ra rằng Atk có chức năng như một phần của con đường tín hiệu insulin ức chế trực tiếp PGC-1γ (peroxisome proliferator activated receptor- coactivator) trong các tế bào gan. Con đường này có thể điều khiển sự tiết lipid ở ĐTĐ type 2 như ức chế PGC-1γ gây ra Akt dẫn đến hạn chế sự oxi hóa axit béo ở gan. Đẩy mạnh tác động của PGC-1γ trong các tế bào gan kháng insulin có thể chống lại s ự không cân bằng lipid quan sát thấy ở ĐTĐ type 2 (Xinghai Li, 2007). Bên cạnh đó, khi nghiên cứu các tế bào thần kinh Huang CJ cùng cộng sự đã khẳng định rằng protein Calcium-activated calpain-2 có liên quan đến sự phá hủy tế bào beta của bệnh nhân ĐTĐ2 (Huang CJ et al, 2010). Như vậy, việc sử dụng các kỹ thuật proteomic trong nghiên cứu hệ protein nói chung 9 của các bệnh nhân ĐTĐ type 2 mở ra cơ hội mới trong việc tìm kiếm các biomarker phục vụ chẩn đoán sớm bệnh. Ở Việt Nam, do tỷ lệ ngày một gia tăng cũng như các nguyên nhân và biến tính phức tạp của bệnh ĐTĐ type 2, nhiều nghiên cứu về dịch tễ, các phương pháp điều trị và dự phòng đã được tiến hành và tổng kết (Tạ Văn Bình và cs, 2006). V ề mặt chẩn đoán, chủ yếu tập trung vào các xét nghiệm đường huyết thanh nhanh, xét nghiệm dung nạp đường qua đường miệng, xét nghiệm đường huyết thanh ngẫu nhiên, xét nghiệm đường máu lúc đói hoặc tầm soát máu bằng chích đầu ngón tay. Như vậy, bệnh thường chỉ được phát hiện khi nồng độ đường trong máu đã tăng cao (Nguyễn Khoa Diệu Vân và cs, 2005; Tạ Văn Bình, 2006). Cũng đã có một số nghiên cứu về quan hệ giữa nồng độ của CPR (C reactive protein) – một protein miễn dịch với BMI (body mass index) một chỉ số ở các bệnh nhân ĐTĐ type 2 (Hoàng Đăng Mịch, 2006), hay giá trị của HBA 1C huyết thanh trong chẩn đoán ĐTĐ (Nguyễn Thị Phương Mai và cs, 2006). Nghiên cứu proteomics đối với leukemia Leukemia là một dạng ung thư của cơ quan tạo ra các huyết cầu như tủy xương và hệ thống bạch huyết (lymph system). Trong leukemia các bạch cầu được sản xuất một cách nhanh chóng rối loạn tạo ra các bạch cầu bất thường không hoạt động được và các bạch cầu ung thư này dần dần xâm lấn đến các hồng cầu và tiểu cầu, ngăn chặn sản xuất và phá hủy các tế bào này. Nói chung, leukemia chia làm 2 d ạng cấp tính và mãn tính. Leukemia cấp tính có triệu chứng sớm, tiến triển nhanh, nếu không chẩn đoán và điều trị sớm sẽ đưa đến tử vong nhanh và có nhiều subtyp khác nhau. Leukemia loại mãn tính có tiến triển chậm, thường không có hay có ít triệu chứng trong nhiều năm. Những nghiên cứu proteomics đối với leukemia không chỉ làm sáng tỏ về phân loại leukemia, mà còn góp phần xác định các kháng nguyên ung thư, chẩn đoán sớm và đánh giá quá trình điều trị bệnh (Cui JW et al, 2004; Cui JW et al, 2005). Trong năm năm gần đây, cùng với sự hoàn thiện việc đọc trình tự hệ gen (genome) người là sự phát triển mạnh mẽ các phương pháp, kỹ thuật nhằm xác định chức năng của các gen và mối liên quan giữa chúng. Đã có những nghiên cứu chỉ ra sự chuyển đoạn của các nhiễm sắc thể, các kiểu gen đặc biệt, các đột biến liên quan mật thiết với b ệnh ung thư bạch cầu. Kết quả của những thay đổi trên được phát hiện thấy cả ở mức độ biểu hiện mRNA, mức độ biểu hiện protein nhờ các phương pháp chính như RT-PCR, DNA microarray, các kỹ thuật/cách tiếp cận nghiên cứu proteomics như điện di 2 chiều, điện di 2 chiều nhuộm huỳnh quang (2D-DIGE), khối phổ (MALDI/SELDI-MS/MS), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Các gen mã hóa cho CREB (cAMP response element binding protein), PRAME (preferentially expressed antigen in melanoma), FLT3 (Fetal Liver Tyrosine Kinase 3), p14 ARF và p16 INK4a , MTHFR là một vài trong số rất nhiều gen đã được phát hiện có mức độ biểu hiện mRNA bất thường liên quan tới bệnh bạch cầu. Mặt khác, chúng cũng được xem như đích đến của các loại thuốc dùng điều trị bệnh. Mã hóa cho protein bám nhân tố đáp ứng cAMP, CREB điều khiển các gen chịu trách nhiệm cho các quá trình tăng số lượng/trưởng, biệt hóa và sự sống sót của tế bào (Sakamoto KM, Frank DA, 2009). CREB [...]... trong huyết thanh người bệnh ĐTĐT2 và leukemia thì các mẫu người bình thư ng là một phần không thể thiếu Chúng được xem như các mẫu đối chứng để đối chiếu với những mẫu bệnh Các số liệu nhận được là cơ sở để xây dựng dữ liệu về hệ protein huyết thanh người Việt Nam bình thư ng, góp phần nghiên cứu những thông số của người Việt Nam bình thư ng và nguồn để tra cứu các 23 biến đổi về protein huyết thanh. .. được chọn là +2 (double charge) và +3 (triple charge) Mức độ chính xác được đặt mặc định là 99,5% Với các thông số như trên thì kết quả sẽ cho các protein có tổng điểm số trên 31 Việc phân tích dữ liệu phổ giới hạn trong Ngân hàng Dữ liệu Protein của Homo sapiens của toàn bộ Ngân hàng Dữ liệu NCBInr 9 Xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người: sử dụng hệ quản trị ngân hàng dữ liệu Microsoft... Thang protein Marker chuẩn; Đường chạy 1: Protein huyết thanh nguyên pha loãng 40 lần; Đường chạy 2: Protein bền nhiệt thu được từ huyết thanh người bình thư ng (đối chứng); Đường chạy 3 đến 6: Protein bền nhiệt thu được từ một số mẫu bệnh ĐTĐT2 1 .2. 1.3 Phân tách và thu nhận các glycoprotein trong huyết thanh người bình thư ng và bệnh lý Để thu nhận các glycoprotein, mẫu huyết thanh được phân tách qua... hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia” giai đoạn 20 08 -20 10 đã được phê duyệt Mục đích của đề tài là nghiên cứu một cách có hệ thống hệ protein huyết thanh người Việt Nam ở trạng thái bình thư ng và các trạng thái bệnh ĐTĐT2 và leukemia, tìm kiếm những protein có biến đổi đặc trưng cho các trạng thái bệnh có khả năng phát triển thành các chỉ thị chẩn đoán 14 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP... bộ và hiện đại về proteomics được đầu tư theo Dự án “Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen” tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam và những kết quả nghiên cứu bước đầu về xác lập các phương pháp phân tích protein/ proteome, tìm kiếm các chỉ thị protein trong huyết thanh người trong thời gian qua, đề tài Xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam để phối hợp chẩn đoán. .. protein; Trong báo cáo này chúng tôi sẽ trình bày các kết quả nghiên cứu theo thứ tự nội dung đã đăng kí 1 NỘI DUNG 1 - Phân tích, xây dựng cơ sở dữ liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam bình thư ng và một số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2 và leukemia) bằng các kỹ thuật proteomics Trong phần Nội dung 1 gồm 4 phần chính sau: (1) Lựa chọn đối tượng nghiên cứu: gồm các mẫu người bình thư ng,... liệu thống kê (Microsoft Excel) 21 PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Theo Thuyết minh/Hợp đồng thì đề tài cần thực hiện 3 nội dung chính sau: (1) Nội dung 1: Phân tích, xây dựng CSDL hệ protein huyết thanh người Việt Nam bình thư ng và một số trạng thái bệnh lý (ĐTĐT2 và leukemia) bằng các kỹ thuật proteomics (2) Nội dung 2: Nhận dạng và xác định các ứng viên chỉ thị protein (protein markers); (3) Nội dung... T Nữ 27 BT83 Trần Thị Phương H Nữ 28 BT77 Nịnh Thị L Nữ 29 BT96 Vi Thị C Nữ 25 30 BT98 Lỷ Quang B Nam Các mẫu máu /huyết thanh được đánh số, ghi nhãn và sắp xếp trong những hộp đựng mẫu riêng, bảo quản ở tủ lạnh sâu trong Ngân hàng máu /huyết thanh của đề tài 1.1 .2. Thu thập các mẫu máu người bệnh đái tháo đường type 2 Để có thể sử dụng các chỉ thị sinh học phục vụ cho việc chẩn đoán sớm bệnh ĐTĐT2 thì... T Nam 1971 Nhẹ 27 21 66 Trương Văn M Nam 1975 Nhẹ 22 70 Trần Doãn B Nam 1966 Nhẹ 23 72 Hà Văn K Nam 1933 Nhẹ 24 74 Nguyễn Thị N Nữ 19 42 Nhẹ 25 75 Trần Hữu T Nam 1954 Nhẹ 26 77 Nguyễn Thị T Nữ 1943 Nhẹ 27 79 Vũ Thị T Nữ 1954 Sớm 28 83 Nguyễn Thị Đào Nữ 1970 Sớm 29 84 Lê Tiến D Nam 1940 Sớm 30 85 Nguyễn Văn H Nam 1955 Sớm 1.1.3 Thu thập các mẫu máu /huyết thanh người bệnh leukemia Việc lựa chọn mẫu bệnh. .. Chết 15/1 /20 09 Chết 1/3/ 20 09 29 Nữ 49 Nữ 25 Hà Thu M Nữ 15 Nguyễn Văn P 16 Nguyễn Thị T 17 Lê Văn R 18 Nguyễn Thị N Nữ 46 19 Nguyễn T Thanh T Nữ 38 20 Phùng Thị H Nữ 26 21 Trương Văn T 22 Nguyễn Thị N 23 Thân Quang D 24 Lại Thị L 13 Hoàng Thị H 14 ALL2 (5?) L2.4 ALL2 L2.6 48 AML1 M1.1 Chưa Sou, Pe, Es 45,-C Nam 26 AML2 M2.1 Chưa Sou, Pe, Es 46,XY Nữ 38 AML2 M2 .2 Chưa Sou, Pe, Es 46,XX Nam 12 Chưa Sou, . CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI XÂY DỰNG NGÂN HÀNG DỮ LIỆU HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI VIỆT NAM ĐỂ ĐỐI PHÓ CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 VÀ UNG THƯ . Xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam để phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia” giai đoạn 20 08 -20 10 với mục đích nghiên cứu có hệ thống hệ protein. trong huyết thanh người trong thời gian qua, đề tài Xây dựng ngân hàng dữ liệu hệ protein huyết thanh người Việt Nam để phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia” giai đoạn 20 08 -20 10