2. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG
2.2.2. Thực nghiệm
a) Nguyên liệu
- Mẫu vỏ loài Citrus đƣợc thu hái ở các nơi khác nhau, phơi khô, đƣợc xác định tên khoa học, đánh số ký hiệu, lƣu ở Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu. Mỗi mẫu khô đƣợc lấy một ít nghiền thành bột mịn dùng cho nghiên cứu.
- Dung môi, hoá chất: dung môi cho HPLC gồm methanol PA, acid phosphoric PA, acetonitril HPLC, nƣớc cất hai lần (lọc để đủ tiêu chuẩn chạy HPLC); các dung môi dùng để chiết xuất mẫu đạt tiêu chuẩn công nghiệp.
- Chất chuẩn naringin và hesperidin đƣợc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TW cung cấp.
b) Chuẩn bị mẫu đối chiếu Mẫu đối chiếu naringin
Cân chính xác 0,0050 g naringin đối chiếu vào bình định mức 50 ml. Thêm 40 ml methanol, lắc siêu âm đến hoà tan hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm methanol đến vạch và lắc đều. Hút chính xác 1 ml dung dịch thu đƣợc vào bình định mức 10 ml. Thêm methanol đến vạch và lắc đều. Đo độ hấp thụ của dung dịch naringin đối chiếu ở bƣớc sóng 283 nm so với methanol (Dc).
Mẫu đối chiếu hesperidin
Cân chính xác 0,0050 g hesperidin đối chiếu vào bình định mức 250 ml. Thêm 200 ml methanol, lắc siêu âm đến hoà tan hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm methanol đến vạch và lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch thu đƣợc vào bình định mức 10 ml. Thêm methanol đến vạch và lắc đều. Đo độ hấp thụ của dung dịch hesperidin đối chiếu ở bƣớc sóng 283 nm so với methanol (Dc).
c) Chuẩn bị mẫu thử từ dược liệu
Cân chính xác khoảng 2,5g bột dƣợc liệu (P g) cho vào túi giấy lọc rồi cho vào bình Soxhlet. Chiết với n-hexan cho đến khi dịch chiết không màu. Lấy túi giấy lọc đựng dƣợc liệu ra để bay hơi hết n-hexan ở nhiệt độ phòng rồi cho vào bình Soxhlet chiết tiếp với methanol
trong 12 giờ đến khi dịch chiết không màu. Dịch chiết thu đƣợc chuyển định lƣợng vào bình cất quay và đem cô dƣới áp suất giảm đến khô kiệt. Hoà cắn trong 50 ml methanol rồi chuyển định lƣợng vào bình định mức 100 ml. Rửa bình cầu 2-3 lần bằng methanol, chuyển dịch rửa vào bình định mức. Thêm methanol đến vạch, lắc đều, thu đƣợc dung dịch A. Hút chính xác 1 ml dung dịch A vào bình định mức 50 ml. Thêm methanol đến vạch, lắc đều thu đƣợc dung dịch thử. Đo độ hấp thụ của dung dịch thử ở bƣớc sóng 283 nm so với methanol (Dx).
Cân chính xác khoảng 0,100 gam (P g) bột chế phẩm citroflavonoid vào cốc thuỷ tinh. Hoà tan bột trong 50 ml methanol rồi chuyển định lƣợng vào bình định mức 100 ml. Rửa cốc 2-3 lần bằng methanol, chuyển dịch rửa vào bình định mức. Thêm methanol đến vạch, lắc đều, thu đƣợc dung dịch A. Hút chính xác 1 ml dung dịch A vào bình định mức 50 ml. Thêm methanol đến vạch, lắc đều. Thu đƣợc dung dịch thử. Đo độ hấp thụ của dung dịch thử ở bƣớc sóng 283 nm so với methanol (Dx).
Hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần trong trong dƣợc liệu đƣợc tính theo công thức:
Dx × 5 × 100
X(%) =
Dc × P × (100 - W)
Trong đó:
X: Hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần trong dƣợc liệu tính theo naringin hoặc hesperidin (%)
P: Khối lƣợng bột dƣợc liệu đã cân để định lƣợng (g) Dx: Mật độ quang của mẫu thử ở 283 nm.
Dc: Mật độ quang của mẫu naringin hoặc hesperidin đối chiếu ở 283 nm. W: Độ ẩm của bột dƣợc liệu (%)
Hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm chiết xuất đƣợc tính theo công thức:
Dx ×5 X(%) =
Dc × P
Trong đó:
X: Hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần tính theo naringin hoặc hesperidin trong sản phẩm chiết xuất (%)
P: Khối lƣợng sản phẩm chiết xuất đã cân để định lƣợng (g) Dx: Mật độ quang của mẫu thử ở 283 nm.
Dc: Mật độ quang của mẫu naringin hoặc hesperidin đối chiếu ở 283 nm.