1. Bàn luận về các kết quả nghiên cứu đã thu đƣợc
1.4. Nghiên cứu và lựa chọn đƣợc qui trình chiết xuất citroflavonoid ở qui mô phòng thí
nghiệm (1 kg/mẻ) để áp dụng cho qui trình sản xuất ở qui mô lớn (>100 kg/mẻ)
Sau khi lựa chọn hesperidin là đối tƣợng cho nghiên cứu chiết xuất ở qui mô pilit, trƣớc tiên nhóm nghiên cứu phải xây dựng qui trình chiết xuất ở qui mô nhỏ, có định hƣớng để áp dụng cho qui mô lớn hơn. Các tiêu chí cần quan tâm là:
- Lựa chọn đƣợc điều kiện chiết xuất tối ƣu: dung môi chiết, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu, kích thƣớc dƣợc liệu.
- Lựa chọn đƣợc qui trình loại tạp chất (để nâng cao hàm lƣợng citroflavonoid). - Xác định đƣợc hiệu suất chiết xuất ổn định.
- Phân tích và lựa chọn đƣợc qui trình tối ƣu.
Đầu tiên là sự lựa chọn dung môi chiết xuất, sau khi khảo sát tất rất nhiều hệ dung môi khác nhau, gồm có: cồn 96%, cồn 80%, cồn 70%, cồn 60%, metanol, nƣớc vôi trong. Kết quả cho thấy sử dụng cồn 70% là cho hiệu quả mong muốn. Với mong muốn có hiệu quả kinh tế khi áp dụng ở qui mô lớn, nhóm nghiên cứu cũng đã thử chiết xuất hesperidin bằng nƣớc vôi trong, kể cả nƣớc nóng, và cả bằng hỗn hợp kiềm-cồn. Tất cả đều cho hiệu xuất thấp và sản phẩm thu đƣợc có hàm lƣợng citroflavonoid rất thấp, thấp nhất là chiết ở nhiệt độ thƣờng, ngay cả khi dùng hỗn hợp nƣớc vôi trong (kiềm) trong cồn 70%. Có thể giải thích kết quả này là hesperidin là một chất ít phân cực so với các flavonoid glycosid khác, và có tính acid rất yếu nên rất ít tan trong nƣớc, kể cả dung dịch kiềm. Nhƣ vậy sử dụng nƣớc vôi trong hay hỗn hợp kiềm-cồn sẽ không cho hiệu suất chiết xuất cao.
Khi khảo sát điều kiện về nhiệt độ thì cho kết quả khi chiết ở nhiệt độ sôi của dung môi luôn luôn cho hiệu suất chiết cao nhất, đồng thời cũng tốn ít thời gian nhất. Vì vậy, việc lựa chọn chiết xuất ở nhiệt độ sôi của dung môi là tƣơng đối dễ dàng.
Việc lựa chọn về thời gian chiết xuất cũng không đơn giản. Thực chất thì thời gian chiết lâu sẽ cho hiệu suất chiết xuất cao hơn, chiết càng nhiều lần thì càng lấy đƣợc nhiều hoạt chất và do đó hiệu suất chiết xuất càng lớn. Tuy nhiên, nếu càng chiết lâu, càng chiết nhiều lần thì cũng sẽ có nhiều chất cùng ra, điều này gây khó khăn khi loại tạp. Mặt khác nếu chiết lâu và nhiều lần thì khi áp dụng ở qui mô lớn sẽ tốn thời gian, tốn nguyên vật liệu và do đó hiệu quả kinh tế chƣa chắc đã cao. Cuối cùng thì nhóm nghiên cứu đã lựa chọn chiết xuất trong 3 giờ cho mỗi lần chiết và mỗi mẻ đƣợc chiết 3 lần. Nhƣ thế thì lƣợng citroflavonoid còn lại trong dƣợc liệu là không đáng kể, và khi áp dụng ở qui mô lớn hơn sẽ tiết kiệm đƣợc dung môi, năng lƣợng, thời gian và công lao động.
Khảo sát về tỉ lệ dung môi/dƣợc liệu cho thấy chiết xuất ở tỉ lệ 10/1 (tức là 1kg dƣợc liệu cần 10 lít dung môi) là hợp lý nhất. Tất nhiên khi tăng tỉ lệ này lên trên 10/1 thì hiệu suất chiết xuất cũng tăng nhƣng không đáng kể, trong khi không tiết kiệm đƣợc dung môi và tốn nhiều năng lƣợng hơn, tốn nhiều thời gian cho quá trình lọc và thu hồi dung môi.
Về kích thƣớc dƣợc liệu, thật ngạc nhiên khi để dƣợc liệu thái lát (kích thƣớc lát khoảng 5-10 mm) cho hiệu quả cao hơn là xay nhỏ dƣợc liệu, thái vụn (<2mm) và thái nhỏ (2-5 mm). Sau khi phân tích thì chúng tôi nhận thấy thông thƣờng vỏ quả giữa (lớp chứa hoạt chất
citroflavonoid) của dƣợc liệu tƣơng đối mỏng, xốp, rất dễ để dung môi ngấm vào và tiếp xúc trực tiếp với các hoạt chất citroflavonoid và hòa tan chúng. Lớp vỏ quả ngoài không chứa citroflavonoid nhƣng lại chứa nhiều tinh dầu và các chất màu khác, tuy nhiên, chúng đƣợc chứa trong các túi tinh dầu rất khó bị phá vỡ nên nếu để nguyên vỏ quả thì dung môi rất khó tiếp xúc và hòa tan đƣợc các chất này. Sản phẩm chiết xuất vì vậy mà có ít tạp hơn, hàm lƣợng citroflavonoid cao hơn, và dễ dàng trong quá trình loại tạp. Khi càng thái mỏng, vụn thì các túi chứa tinh dầu ở vỏ quả ngoài càng bị vỡ nhiều nên sản phẩm chiết xuất càng có nhiều tạp chất, gây khó khăn trong quá trình loại tạp và do đó làm giảm hiệu suất của qui trình. Việc thái vụn, xay nhỏ dƣợc liệu cũng gây rất nhiều khó khăn cho việc lọc dung môi, trong khi tốn thêm công lao động và năng lƣợng lúc xay hay thái dƣợc liệu. Kết luận cuối cùng của nhóm nghiên cứu là việc thái lát dƣợc liệu sẽ cho hiệu quả kinh tế cao nhất khi áp dụng ở qui mô pilot về sau, trong khi vẫn cho hiệu suất chiết xuất cao nhất.
Nghiên cứu qui trình loại tạp, do hesperidin chỉ tan tốt trong cồn nóng, rất ít tan trong cồn lạnh và thực tế không tan trong nƣớc, trong khi nhiều tạp chất có thể tan trong cồn. Do đó, chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp tủa trong cồn lạnh để thu đƣợc tủa hesperidin có hàm lƣợng cao hơn. Ƣu điểm của phƣơng pháp là rất đơn giản, rất dễ thực hiện, tốn ít dung môi, nhiên liệu, ít độc hại. Nhƣng phƣơng pháp này vẫn tồn tại nhƣợc điểm là loại bỏ mất một số citroflavonoid tan đƣợc trong cồn, trong khi vẫn không loại đƣợc các tạp chất ít tan trong cồn. Các hoạt chất ít tan trong cồn có thể có tinh dầu, các limonoid, các terpenoid, và các chất vô cơ cũng có rất ít độc hại đối với cơ thể nên có thể chấp nhận đƣợc.
Sau khi khảo sát tất cả các điều kiện nhƣ trên, nhóm nghiên cứu tiến hành chiết xuất nhiều mẻ khác nhau để xây dựng qui trình có qui mô 1kg/mẻ theo hƣớng để áp dụng ở qui mô lớn hơn. Qui trình cho độ ổn định cao, hiệu suất chiết xuất là so với dƣợc liệu là 6,68 – 7,22%, và là 65,16 – 69,45% so với citroflavonoid có trong dƣợc liệu. Sản phẩm thu đƣợc ở dạng bột mịn màu vàng, có hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần tính theo hesperidin là 78,82 – 82,87%. Từ đó có thể kết luận qui trình chiết xuất citroflavonoid đã xây dựng khá ổn định.
Tất cả các nghiên cứu chiết xuất trƣớc đây [39-42] đều không khảo sát hiệu suất chiết xuất và độ ổn định của qui trình theo các điều kiện dung môi chiết, nhiệt độ, thời gian và số lần chiết, tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu, kích thƣớc dƣợc liệu. Vì để áp dụng cho qui mô lớn nên chúng tôi bắt buộc phải khảo sát các điều kiện này, góp phần định hƣớng cho việc ứng dụng thực tiễn.