1. Bàn luận về các kết quả nghiên cứu đã thu đƣợc
1.2. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính, định lƣợng các flavonoid bằng sắc ký lớp
mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Một trong những yếu tố vô cùng quan trọng để có đƣợc hiệu xuất chiết xuất cao và ổn định là hàm lƣợng của hoạt chất trong dƣợc liệu. Cho dù qui trình chiết xuất có khoa học và tốt đến mấy, trang thiết bị sử dụng có hiện đại đến mấy, nhƣng hàm lƣợng hoạt chất thấp hay không ổn định thì hiệu suất chiết xuất cũng không cao và không ổn định đƣợc. Mặt khác, với mỗi một qui trình chiết xuất nhất định thì hiệu suất chiết xuất chỉ ổn định khi hàm lƣợng của hoạt chất trong dƣợc liệu đạt đƣợc một giá trị nhất định nào đó. Tất cả những điều này đã chỉ rõ
rằng chúng ta phải kiểm soát đƣợc hàm lƣợng hoạt chất trong nguyên liệu trƣớc khi có quyết định chiết xuất hay không.
Để giải quyết vấn đề này, trƣớc tiên nhóm nghiên cứu đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính 4 citroflavonoid bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) rất đơn giản và dễ dàng áp dụng ở nhiều cơ sở nghiên cứu cũng nhƣ các phòng nghiên cứu của các công ty dƣợc. Sau đó, chúng tôi cũng đã xây dựng đƣợc qui trình định lƣợng citroflavonoid toàn phần theo phƣơng pháp đo quang (UV-VIS) và áp dụng đƣợc phƣơng pháp này để khảo sát hàm lƣợng citroflavonoid trong các mẫu nghiên cứu. Đây là phƣơng pháp đã đƣợc qui định trong Dƣợc điển Việt Nam IV [45] và Dƣợc điển Trung Quốc 2005 [61]. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là nhanh, rẻ, dễ thực hiện ở đa số các đơn vị trong nƣớc do nhu cầu về dung môi, hóa chất và máy móc đơn giản. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp lại là dễ gây sai số thừa vì nhiều hợp chất phenol khác cũng cho phản ứng dƣơng tính nhƣ citroflavonoid. Vì vậy, nhóm nghiên cứu chỉ sử dụng phƣơng pháp này chỉ đƣợc sử dụng cho các khảo sát, sàng lọc ban đầu, và khi cần so sánh tƣơng đối giữa các mẫu với nhau, các sản phẩm trung gian (trong quá trình chiết xuất) không cần độ chính xác tuyệt đối. Ở các phép định lƣợng cần độ chính xác tốt hơn, ví dụ nhƣ khi kiểm tra hàm lƣợng citroflavonoid trong nguyên liệu trƣớc khi chiết xuất hay sản phẩm cuối cùng trƣớc khi đóng gói bảo quản, thì nhóm nghiên cứu đề xuất sử dụng phƣơng pháp có độ chính xác cao hơn. Dƣợc điển Trung Quốc 2010 đã đƣa tiêu chí định lƣợng flavonoid trong nguyên liệu vỏ quả các loài Citrus bằng phƣơng pháp HPLC [62].
Vì phƣơng pháp đo quang có nhƣợc điểm là gây sai số thừa nên nếu sử dụng, chúng ta sẽ không biết đƣợc chính xác hàm lƣợng của citroflavonoid trong các mẫu nghiên cứu. Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi tiến hành xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hàm lƣợng citroflavonoid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả là đã xây dựng đƣợc các phƣơng pháp định lƣợng naringin và hesperidin từ dƣợc liệu (hoặc từ mẫu sản phẩm) với detector UV, do hai hoạt chất hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại. Qua khảo sát vỏ quả các loài
Citrus thu thập đƣợc, nhóm nghiên cứu nhận thấy:
- Vỏ quả Citrus có chứa hai hoạt chất chính là naringin và hesperidin, các flavonoid khác chiếm hàm lƣợng rất thấp.
- Không có vỏ quả loài Citrus nào không có ít nhất một trong hai chất hesperidin và naringin.
- Tiến hành định lƣợng sơ bộ hàm lƣợng hesperidin và naringin bằng HPLC tính theo diện tích pic của các mẫu vỏ quả Citrus cho biết hàm hai chất hesperidin và naringin chiếm hơn 90% hàm lƣợng citroflavonoid trong mẫu. Do đó, có thể đánh giá chất lƣợng nguyên liệu theo hai citroflavonoid này, và nhóm nghiên cứu đặt vấn đề chỉ lấy chỉ tiêu là hàm lƣợng của hai chất này trong vỏ quả các loài Citrus để đánh giá chất lƣợng của chúng phục vụ cho việc chiết xuất ở qui mô lớn.
- Xây dựng qui trình định lƣợng naringin hoặc hesperidin từ vỏ quả bằng HPLC. Kết quả cho biết khoảng tuyến tính rộng, có thể áp dụng để định lƣợng chính xác hàm lƣợng naringin hoặc hesperidin từ dƣợc liệu hay mẫu bán sản phẩm.
- Khi tiến hành chạy sắc ký đồng thời hai chất naringin và hesperidin bằng HPLC với điều kiện thích hợp, hai chất có thời gian lƣu (tR) khác nhau. Các píc tƣơng ứng của hai chất tách hẳn ra và có thể tính đƣợc diện tích hai píc riêng lẻ.
Với những kết quả sơ bộ nhƣ trên, nhóm nghiên cứu quyết định xây dựng qui trình định lƣợng đồng thời naringin và hesperidin trong vỏ quả của các loài Citrus (hoặc một mẫu dƣợc
liệu bất kỳ nào đó) bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả đã cho một qui trình đã áp đƣợc áp dụng thành công để xác định hàm lƣợng các chất này trong các mẫu dƣợc liệu, các mẫu sản phẩm chiết xuất. Với qui trình này, chúng ta có thể định lƣợng cả 2 citroflavonoid đồng thời, tiết kiệm đƣợc thời gian, dung môi, hóa chất mà vẫn có kết quả chính xác. Đây là một ý tƣởng và kết quả mới của nhóm nghiên cứu và có thể ứng dụng đƣợc trong kiểm nghiệm dƣợc liệu, trong nghiên cứu và trong đào tạo. Công trình này đã đƣợc đăng trên Tạp chí Dƣợc liệu, năm 2011, số 1+2, trang 9-19 (Có phụ lục kèm theo) với tiêu đề “Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng đồng thời naringin và hesperidin trong vỏ quả của các loài
Citrus”.
Với mục đích có đƣợc chất đối chiếu, chúng tôi cũng đã phân lập, điều chế, và xác định cấu trúc 4 hoạt chất chính trong vỏ quả các loài Citrus là naringin, hesperidin, naringenin,
hesperitin. Các chất này đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu trong các nghiên cứu của đề tài, phục vụ việc kiểm nghiệm nguyên liệu và sản phẩm bột citroflavonoid. Chúng tôi cũng hoàn thành và lƣu giữ đƣợc bộ phổ và các thông số lý-hóa của của 4 hoạt chất trên, là các số liệu cần thiết để tham khảo, tra cứu cho các nghiên cứu hay đào tạo về sau.