tế bào, không có thoái hóa hoại tử tế bào. Khoảng cửa không viêm, không xung huyết. Kết quả này thu đƣợc với cả thỏ đƣợc uống thuốc 30 ngày liên tục và uống thuốc và thỏ đƣợc nuôi tiếp 15 ngày sau khi ngừng thuốc.
Hình ảnh vi thể thận:
- Lô 2 (Lô chứng): Cầu thận kích thƣớc đều, không teo. Ống thận không thoái hóa. Lòng ống thận không chứa trụ trong, trụ hạt. Mô kẽ không viêm, không xung huyết.
- Lô 1 (uống bột citroflavonoid): Cầu thận kích thƣớc đều, không xung huyết, không teo, không xơ hóa. Ống thận không có tổn thƣơng. Mô kẽ không xung huyết, không viêm. Kết quả này thu đƣợc với thỏ đƣợc uống thuốc 30 ngày liên tục và uống thuốc và thỏ đƣợc nuôi tiếp 15 ngày sau khi ngừng thuốc.
11.4. Kết luận
Cho thỏ uống bột citroflavonoid liều 600 mg/kg trong 30 ngày liên tiếp và sau khi ngừng thuốc 15 ngày, không thấy có ảnh hƣởng có ý nghĩa thống kê đến thể trọng thỏ, chức năng tạo máu, chức năng gan, chức năng thận trên các chỉ số sinh hóa, huyết học của thỏ. Bột citroflavonoid không gây ra tổn thƣơng trên đại thể và vi thể gan, thận. Quan sát đại thể tim, phổi, lách, tụy và hệ thống tiêu hóa cũng thấy không có tổn thƣơng.
Kết hợp với kết quả thử độc tính cấp, nhóm nghiên cứu kết luận rằng sản phẩm bột citroflavonoid có độ an toàn cao [3].
12. TÁC DỤNG PHÒNG CHỐNG VỮA XƠ ĐỘNG MẠCH CỦA SẢN PHẨM BỘT CITROFLAVONOID CITROFLAVONOID
12.1. Thực nghiệm
12.1.1. Nguyên vật liệu
Sản phẩm citroflavonoid dạng bột, màu vàng, là sản phẩm chiết xuất từ vỏ quýt ở qui mô pilot. Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu đạt Tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng.
Hoá chất phục vụ nghiên cứu
Cholesterol tinh khiết (Merck – Đức) Dầu lạc (Công ty Cái Lân – Việt Nam) Atorvastatin viên nén 20 mg ( - Ấn Độ)
Kit định lƣợng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: cholesterol toàn phần, TG, LDL-C, HDL-C của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo). Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học đạt tiêu chuẩn sử dụng cho thí nghiệm sinh học.
Động vật thực nghiệm
Thỏ chủng Newzealand white, cả hai giống, khoẻ mạnh, lông trắng, trọng lƣợng 1,8 – 2,5 kg do Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây cung cấp. Động vật thực nghiệm đƣợc nuôi 3 ngày trƣớc khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn riêng cho từng loại (do Công ty liên doanh Guyomarc’h-VCN cung cấp) tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y Hà Nội.
12.1.2. Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ đã mô tả trong Phần 2, Mục 4.7.4.
12.2. Kết quả
12.2.1. Ảnh hưởng của thuốc thử trên các chỉ số lipid máu
Bảng 35 biểu diễn tác dụng của việc uống sản phẩm citroflavonoid lên nồng độ triglycerid trong máu thỏ thí nghiệm. Kết quả cho thấy sau 4, 8, và 10 tuần uống thuốc liên tục, nồng độ triglycerid máu thỏ của lô 2 (lô mô hình) tăng rõ rệt so với lô 1 (lô chứng sinh học) và có ý nghĩa thống kê (p < 0,05): sau 4 tuần tăng 48,6%, sau 8 tuần tăng 76,4%, sau 10 tuần tăng 86,5%.
Ở các lô uống thuốc, nồng độ triglycerid máu thỏ của lô 3 (lô uống atorvastatin), lô 4 (lô uống citroflavonoid liều thấp) và lô 5 (lô uống citroflavonoid liều cao) không có sự khác biệt so với lô 2 (lô mô hình) (p > 0,05). Sau 10 tuần uống bột citroflavonoid, nồng độ triglycerid máu của 2 lô thuốc thử đã có mức giảm nhiều so với lô mô hình, lô thuốc thử liều cao có mức giảm nhiều hơn (38,6%) so với lô thuốc thử liều thấp (36,3%). Sự khác biệt về nồng độ triglycerid máu của lô thỏ uống thuốc thử liều cao so với lô mô hình có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Bảng 35. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ triglycerid
Lô Nồng độ triglycerid (mg/dL)
Trƣớc uống 4 tuần 8 tuần 10 tuần
Lô 1 128,95 ± 10,22 122,98 ± 13,47 137,49 ± 32,32 135,42 ± 16,67 Lô 2 131,52 ± 27,66 182,76 ± 52,37a 242,54 ± 74,14a 252,54 ± 01,39a Lô 3 125,54 ± 16,62 182,76 ± 45,40 226,31 ± 44,51 176,49 ± 16,79 Lô 4 124,68 ± 19,80 179,34 ± 52,18 210,08 ± 31,75 160,84 ± 6,43 Lô 5 126,39 ± 20,05 166,53 ± 33,74 190,44 ± 37,56 154,94 ± 19,98b Ghi chú: a p < 0,05 so với lô 1; b p < 0,05 so với lô 2.
Kết quả nồng độ cholesterol toàn phần trong máu thỏ sau khi uống bột citroflavonoid đƣợc trình bày trong Bảng 36. Sau thời gian 4, 8, và 10 tuần uống thuốc liên tục, nồng độ cholesterol toàn phần của lô 2 (lô mô hình) luôn có xu hƣớng tăng, gấp khoảng 5 lần so với lô 1 (lô chứng sinh học). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Sau khi uống thuốc, nồng độ cholesterol toàn phần của lô 3 (lô uống atovastatin) giảm so có ý nghĩa thống kê với lô 2 (lô mô hình): giảm 8,4% sau 4 tuần, giảm 14% sau 8 tuần, và 24,2% sau 10 tuần. Tuy nhiên, nồng độ cholesterol toàn phần của 2 lô thuốc thử có ít sự thay đổi so với lô mô hình và sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
Bảng 36. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ cholesterol toàn phần
Lô Nồng độ cholesterol toàn phần (mg/dL)
Trƣớc 4 tuần 8 tuần 10 tuần
Lô 1 82,22 ± 11,22 81,06 ± 12,07 81,06 ± 8,73 80,40 ± 6,18 Lô 2 84,53 ± 11,28 386,39 ± 26,40a 400,86 ± 36,08a 438,94 ± 32,8a Lô 3 82,99 ± 11,69 353,96 ± 36,30b 344,70 ± 19,64b 332,67 ± 16,54b Lô 4 84,15 ± 14,30 391,02 ± 22,22 398,74 ± 51,79 423,96 ± 29,84 Lô 5 84,15 ± 9,24 391,79 ± 24,02 397,19 ± 37,07 429,09 ± 32,08 Ghi chú: a p < 0,05 so với lô 1; b p < 0,05 so với lô 2.
Bảng 37 biểu diễn kết quả tác dụng của thuốc đến nồng độ HDL-cholesterol của thỏ sau khi uống bột citroflavonoid. Nồng độ HDL-cholesterol của lô mô hình (lô 2) tăng cao có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học (lô 1): sau 4 tuần tăng gấp 5,3 lần, sau 8 tuần tăng gấp 6,5 lần, và sau 10 tuần tăng 6,62 lần.
Ở các lô thỏ uống thuốc thử, nồng độ HDL-cholesterol của lô uống atorvastatin và 2 lô uống citroflavonoid đều không có nhiều sự khác biệt so với lô mô hình. Các kết quả khác nhau không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
Bảng 37. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ HDL- cholesterol
Lô Nồng độ HDL-cholesterol (mg/dL)
Trƣớc 4 tuần 8 tuần 10 tuần
Lô 1 29,31 ± 4,05 30,38 ± 3,37 29,54 ± 2,97 28,79 ± 4,21 Lô 2 29,85 ± 3,38 161,92 ± 39,40a 193,19 ± 22,33a 190,66 ± 19,84a Lô 3 28,88 ± 4,24 105,23 ± 31,30b 192,04 ± 14,62 185,26 ± 23,13 Lô 4 30,65 ± 4,42 181,08 ± 26,25 197,96 ± 18,92 182,05 ± 22,25 Lô 5 30,65 ± 2,96 176,23 ± 22,55 208,77 ± 15,75 226,37 ± 44,10 Ghi chú: a p < 0,05 so với lô 1; b p < 0,05 so với lô 2.
Bảng 38 biểu diễn tác dụng của citroflavonoid đến nồng độ LDL-cholesterol trong máu thỏ. Sau khi uống thuốc 4, 8 và 10 tuần liên tục, nồng độ LDL-cholesterol của lô mô hình tăng nhiều so với lô chứng sinh học (tăng cao gấp khoảng 7 lần). sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê.
Nồng độ LDL-cholesterol của lô uống atorvastatin (lô 3) so với lô mô hình sau 4 tuần chƣa thấy rõ sự khác biệt. Tuy nhiên, sau 8 và 10 tuần uống, mức giảm lần lƣợt là 32,5% và 43,3%, và có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Nồng độ LDL-cholesterol của 2 lô uống citroflavonoid tuy thấp hơn so với lô mô hình và có xu hƣớng giảm dần qua các tuần, nhƣng sự khác biệt so chƣa có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 38. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ LDL- cholesterol
Trƣớc uống 4 tuần 8 tuần 10 tuần Lô 1 27,12 ± 11,58 26,08 ± 11,22 24,02 ± 6,91 24,52 ± 9,66 Lô 2 28,38 ± 12,65 187,91 ± 42,04a 159,16 ± 22,29a 197,77 ± 33,34a Lô 3 29,00 ± 12,36 212,18 ± 25,41 107,40 ± 18,13b 112,11 ± 32,93b Lô 4 28,56 ± 17,07 174,07 ± 24,63 158,76 ± 46,23 209,74 ± 42,60 Lô 5 28,22 ± 11,24 182,25 ± 36,66 150,34 ± 41,72 171,73 ± 44,89 Ghi chú: a p < 0,05 so với lô 1; b p < 0,05 so với lô 2.
12.2.2. Tác dụng của citroflavonoid lên mô bệnh học
a) Tác dụng trên động mạch chủ
Tại thời điểm sau 8 tuần và 10 tuần uống thuốc, thỏ ở tất cả các lô đƣợc lấy ngẫu nhiên 30% để tiến hành nghiên cứu tác dụng của thuốc đến mô bệnh học. Số thỏ đƣợc lựa chọn đƣợc đem giết, bóc tách lấy động mạch chủ ở các bộ phận tim, phổi, mạch máu để cắt tiêu bản, xét nghiệm đại thể, vi thể của động mạch chủ đoạn ngay trƣớc khi đổ vào động mạch vành.
Kết quả xét nghiệm đại thể và vi thể của động mạch chủ (ĐMC) đƣợc tóm tắt trong Bảng 39.
Bảng 39. Kết quả quan sát đại thể và vi thể động mạch chủ
Lô Đại thể Vi thể
8 tuần 10 tuần 8 tuần 10 tuần
Lô 1 Lòng mạch bình thƣờng, nhẵn, không có mảng xơ vữa. Lòng mạch bình thƣờng, nhẵn, không có mảng xơ vữa ĐMC bình thƣờng ĐMC bình thƣờng
Lô 2 - Xung quanh tim, phổi, mạch máu có nhiều mỡ.
- Lòng ĐMC có nhiều mảng xơ vữa dọc theo chiều dài.
- Nhiều mỡ xung quanh tim, quai ĐMC - ĐM có nhiều mảng xơ vữa toàn bộ lòng mạch. ĐMC mảng vữa mỡ dày mức độ vừa đến nặng, có hoại tử, vôi hóa. ĐMC mảng vữa mỡ dày mức độ vừa, đã có xơ hóa mảng vữa.
Lô 3 - Có ít mỡ xung quanh tim.
- Lòng ĐMC có mảng xơ vữa. Thân ĐMC có ít, quai ĐMC có nhiều mảng xơ vữa rõ.
- Có ít mỡ quanh cuống tim.
- Quai ĐMC có ít mảng xơ vữa; thân ĐMC có rải rác mảng xơ vữa. ĐMC mảng vữa mỡ dày mức độ vừa. ĐMC mảng vữa vỡ mỏng đến vừa, đã có xơ hóa.
Lô 4 - Có mỡ xung quanh tim, phổi, mạch máu - Lòng ĐMC có nhiều mảng xơ vữa; đoạn quai ĐMC bị xơ vữa nhiều hơn đoạn thân.
- Có nhiều mỡ xung quanh tim và quai ĐMC - Quai ĐMC có nhiều mảng bám dày đặc, thân ĐMC ngực có nhiều mảng bám, ĐMC bụng có ít ĐMC mảng vữa mỡ dày mức độ vừa Mảng vữa mỡ lan tỏa có bề dày mức độ vừa, trong mảng vữa mỡ đã xuất hiện các tế bào xơ và hiện tƣợng vôi hóa
mảng bám hơn. Lô 5 - Có mỡ xung quanh
tim, quai ĐMC
- Lòng ĐMC đoạn quai có mảng xơ vữa, đoạn ngực có rất ít mảng xơ vữa.
- Có mỡ xung quanh tim, cuống tim.
- ĐMC có ít mảng xơ vữa ở đoạn quai và đoạn thân. ĐMC mảng vữa mỡ dày mức độ nhẹ đến vừa. Mảng vữa mỡ mức độ vừa và nặng, bắt đầu có biểu hiện xơ hóa và có vùng tái tạo nội mô.
Ghi chú: ĐMC - động mạch chủ.
b) Tác dụng trên gan
Kết quả xét nghiệm đại thể và vi thể của gan đƣợc tóm tắt trong Bảng 40.
Bảng 40. Kết quả quan sát đại thể và vi thể gan
Lô Đại thể Vi thể
8 tuần 10 tuần 8 tuần 10 tuần
Lô 1 Bình thƣờng, màu hồng, bề mặt nhẵn. Bình thƣờng, màu hồng, bề mặt nhẵn. Tế bào gan bình thƣờng. Thoái hóa nhẹ, không nhiễm mỡ. Lô 2 Gan nhiễm mỡ nặng, bạc màu. Gan nhiễm mỡ nặng, bề mặt sần sùi. Gan nhiễm mỡ nặng. Gan nhiễm mỡ mức độ vừa, bào tƣơng TB gan có các hốc sáng nhỏ.
Lô 3 Gan nhiễm mỡ mức
độ vừa. Gan nhiễm mỡ nhẹ.
Gan nhiễm mỡ vừa đến nặng.
Gan nhiễm mỡ mức độ vừa.
Lô 4
Gan nhiễm mỡ vừa đến nặng, bạc màu. Gan nhiễm mỡ nặng, bề mặt gan sần sùi. Gan nhiễm mỡ vừa đến nặng. Gan nhiễm mỡ nặng, chủ yếu ở trung tâm tiểu thùy, các TB gan phồng to, bào tƣơng có nhiều hốc sáng. Lô 5 Gan nhiễm mỡ nhẹ
đến vừa, ít bạc màu.
Gan nhiễm mỡ ít, bề mặt gan ít sần sùi.
Gan nhiễm mỡ vừa.
Gan nhiễm mỡ lan tỏa, mức độ vừa.
12.3. Kết luận
- Thỏ uống citroflavonoid liều 200mg/kg uống liên tục trong 8-10 tuần chƣa thể hiện rõ tác dụng giảm lipid máu. Tuy nhiên, có sự hạn chế xơ vữa động mạch chủ và hạn chế mức độ nhiễm mỡ của gan thỏ ở mô hình gây tăng lipid máu ngoại sinh.
- Thỏ uống citroflavonoid ở liều 500 mg/kg đã thể hiện rõ rệt tác dụng làm hạ triglycerid và LDL-cholesterol. Mức độ hạn chế mức độ xơ vữa động mạch chủ, hạn chế một phần mức độ nhiễm mỡ của gan thỏ.