5.1. Kết quả thử tác dụng dọn gốc tự do
5.1.1. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH
Các chất phân lập đƣợc đƣợc thử tác dụng loại bỏ gốc tự do DPPH để khảo sát tác dụng của nó. Để tìm hiểu qui luật tác dụng-nồng độ, chúng tôi thử tác dụng của các hoạt chất ở các nồng độ 1, 2, 5, 10, 20 g/ml. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 10.
Kết quả cho thấy ở nồng độ 20 mg/ml, hesperetin và naringenin cho tác dụng mạnh gần tƣơng đƣơng nhau, dọn hơn 90% lƣợng gốc tự do. Ở các liều thấp hơn, 2 aglycon này có cho tác dụng giảm dần theo qui luật nồng độ - tác dụng. Tác dụng của 2 aglycon glycosid hesperidin và naringin cũng tƣơng đƣơng nhau, nhƣng yếu hơn nhiều so với 2 aglycon của nó. Điều này chứng minh rằng việc có gắn thêm đƣờng làm giảm tác dụng dọn gốc tự do của flavnoid. Kết quả IC50 đƣợc tổng hợp trong Bảng 15 cho thấy rất rõ điều này.
Bảng 10. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH của các mẫu thử Mẫu thử Tác dụng dọn gốc tự do (%)a 1 g/ml 2 g/ml 5 g/ml 10 g/ml 20 g/ml Hesperidin 5,6 ± 0,1 10,0 ± 0,9 23,0 ± 4,8 39,7 ± 4,3 63,2 ± 3,8 Hesperetin 19,2 ± 1,8 37,8 ± 3,4 51,0 ± 0,8 69,7 ± 1,5 91,6 ± 3,6 Naringin 6,6 ± 1,5 10,4 ± 2,4 21,7 ± 1,7 41,4 ± 3,8 69,2 ± 5,3 Naringenin 11,6 ± 1,6 26,9 ± 0,6 54,4 ± 5,2 76,7 ± 1,7 90,8 ± 2,1 -Tocopherolb 4,7 ± 1,0 15,4 ± 2,9 57,0 ± 5,1 83,1 ± 4,3 97,5 ± 2,6 Rutinb 10,0 ± 0,2 19,1 ± 3,1 50,6 ± 2,3 68,0 ± 2,7 87,9 ± 3,7 a
Giá trị đƣợc hiểu là (%) lƣợng gốc tự do đƣợc dọn, đƣợc biểu diễn bởi trung bình ± SD từ 3 lần làm thí nghiệm khác nhau. b Chất đối chiếu dƣơng.
5.1.2. Tác dụng dọn gốc tự do superoside (O2–●
)
Tác dụng dọn gốc tự do superoxide của các mẫu thử đƣợc trình bày trong Bảng 11. Giống kết quả dọn gốc tự do DPPH, các flavonoid glycosid có tác dụng kém hẳn các aglycon của chúng, chứng tỏ việc có thêm đƣờng trong cấu trúc đã làm giảm tác dụng của các flavonoid. Trong phép thử này, tác dụng của hesperetin (IC50 3,28 g/ml) mạnh hơn hẳn của naringenin (IC50 15,88 g/ml), và của hesperidin (IC50 11,36 g/ml) mạnh hơn hẳn của naringin (IC50 >50 g/ml), chứng tỏ rằng sự khác biệt ở vòng B (có thêm 1 nhóm OCH3) đã làm tăng tác dụng lên đáng kể.
Bảng 11. Tác dụng dọn gốc tự do superoxide của các mẫu thử Mẫu thử Tác dụng dọn gốc tự do O2–● (%)a 1 g/ml 2 g/ml 5 g/ml 10 g/ml 20 g/ml Hesperidin 0,7 ± 0,5 3,6 ± 2,1 15,2 ± 1,2 43,2 ± 4,4 76,8 ± 5,3 Hesperetin 27,4 ± 2,5 37,7 ± 5,8 58,4 ± 2,8 75,7 ± 3,2 87,4 ± 5,1 Naringin KTD KTD 4,7 ± 1,8 16,8 ± 4,1 30,5 ± 3,1 Naringenin 6,1 ± 0,5 12,5 ± 0,9 21,0 ± 1,5 38,2 ± 2,3 61,7 ± 2,2 -Tocopherolb KTD KTD KTD KTD KTD Rutinb 18,5 ± 2,7 23,9 ± 3,1 42,2 ± 1,3 60,2 ± 3,7 84,6 ± 3,5 a
Giá trị đƣợc hiểu là (%) lƣợng gốc tự do đƣợc dọn, đƣợc biểu diễn bởi trung bình ± SD từ 3 lần làm thí nghiệm khác nhau. b Chất đối chiếu. KTD: không có tác dụng.
5.1.3. Tác dụng dọn gốc tự do hydroxy (OH●)
Tác dụng dọn gốc tự do OH● của các mẫu đƣợc trình bày trong Bảng 12. Ở phép thử này, do gốc tự do OH● là gốc có độ hoạt động rất mạnh, rất dễ tham gia phản ứng nên ở nồng độ cao, các hoạt chất mới có tác dụng. Các aglycon vẫn có tác dụng mạnh hơn các glycosid của chúng. Hesperetin (IC50 = 2463 g/ml) có tác dụng mạnh hơn narigenin (IC50 = 4057 g/ml), và hesperidin (IC50 = 4916 g/ml) cho tác dụng mạnh hơn naringin (IC50 >5000 g/ml).
Bảng 12. Tác dụng dọn gốc tự do hydroxy của các mẫu thử
Mẫu thử Tác dụng dọn gốc tự do OH● (%)a 100 g/ml 500 g/ml 1000 g/ml 2000 g/ml 5000 g/ml Hesperidin KTD 4,6 ± 1,1 17,6 ± 2,4 37,9 ± 3,3 57,0 ± 2,4 Hesperetin KTD 7,4 ± 5,2 24,1 ± 3,1 52,4 ± 2,3 69,4 ± 4,4 Naringin KTD KTD KTD 17,8 ± 2,4 36,0 ± 4,8 Naringenin KTD 2,0 ± 1,7 18,5 ± 1,9 41,9 ± 1,7 62,4 ± 4,4 -Tocopherolb KTD KTD KTD KTD KTD Rutinb 1,9 ± 0,4 8,2 ± 4,1 18,3 ± 2,4 44,7 ± 5,2 69,7 ± 5,2 a
Giá trị đƣợc hiểu là (%) lƣợng gốc tự do đƣợc dọn, đƣợc biểu diễn bởi trung bình ± SD từ 3 lần làm thí nghiệm khác nhau. b Chất đối chiếu. KTD: không có tác dụng.
5.2. Tác dụng ức chế sự oxy hóa lipid
Tác dụng ức chế sự oxy hóa lipid đƣợc biểu diễn ở Bảng 13. Tác dụng chống oxy hóa lipid đƣợc thể hiện rất rõ khi các chất có tác dụng dọn gốc tự do. Kết quả thu đƣợc cho thấy hesperetin (IC50 = 14,99 g/ml) có tác dụng mạnh hơn naringenin (IC50 = 82,42 g/ml), hesperidin (IC50 = 47,16 g/ml) có tác dụng mạnh hơn naringin (IC50 = 196,99 g/ml). Điều này chứng tỏ rằng nhóm thế OCH3 ở vòng B đã mang lại tác dụng mạnh hơn rất nhiều cho citroflavonoid. Hesperetin đƣợc chú ý khi có tác dụng chống oxy hóa lipid rất mạnh so với các flavonoid còn lại, mạnh hơn rutin và tƣơng đƣơng với tác dụng của vitamin E.
Bảng 13. Tác dụng chống oxy hóa lipid của các mẫu thử
Mẫu thử Tác dụng chống oxy hóa lipid (%)a
5 g/ml 10 g/ml 20 g/ml 50 g/ml 100 g/ml Hesperidin 0,6 ± 0,8 8,2 ± 3,1 24,1 ± 3,3 53,4 ± 1,4 70,6 ± 2,9 Hesperetin 27,4 ± 2,5 37,7 ± 5,8 58,4 ± 2,8 75,7 ± 3,2 93,9 ± 2,4 Naringin KTD 4,0 ± 1,6 8,5 ± 1,1 23,1 ± 0,8 49,3 ± 7,1 Naringenin 0,6 ± 0,8 4,9 ± 2,2 17,4 ± 2,4 36,7 ± 3,4 60,6 ± 5,3 -Tocopherolb KTD KTD KTD KTD KTD Rutinb 1,9 ± 0,4 8,2 ± 4,1 18,3 ± 2,4 44,7 ± 5,2 69,7 ± 5,2 a
Giá trị đƣợc hiểu là (%) lƣợng gốc tự do đƣợc dọn, đƣợc biểu diễn bởi trung bình ± SD từ 3 lần làm thí nghiệm khác nhau. b Chất đối chiếu. KTD: không có tác dụng.
5.3. Tác dụng chống oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL)
Tác dụng ức chế sự oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) đƣợc biểu diễn ở Bảng 14. Tác dụng chống oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) của các chất đƣợc thể hiện rất rõ hơn tác dụng chống oxy hóa lipid. Trong số các citroflavonoid, hesperetin (IC50 = 4,32 g/ml) vẫn cho tác dụng mạnh nhất, mạnh hơn naringenin (IC50 = 10,06 g/ml). Các flavonoid glycoside có tác dụng yếu hơn aglycon của chúng, hesperidin (IC50 = 14,88 g/ml) có tác dụng mạnh hơn naringin (IC50 >20 g/ml). Kết quả này chứng tỏ rằng nhóm thế OCH3 ở vòng B đã mang lại tác dụng mạnh hơn rất nhiều cho citroflavonoid, đồng thời aglycon có tác dụng mạnh hơn glycoside của chúng. Trong phép thử này, hesperetin có tác dụng chống oxy hóa LDL rất mạnh, mạnh hơn vitamin E và rutin.
Bảng 14. Tác dụng chống oxy hóa LDL của các mẫu thử
Mẫu thử Tác dụng chống oxy hóa LDL (%)a
1 g/ml 2 g/ml 5 g/ml 10 g/ml 20 g/ml Hesperidin 1,7 ± 1,1 7,9 ± 2,7 24,3 ± 2,4 37,8 ± 3,0 63,6 ± 4,9 Hesperetin 25,4 ± 3,3 33,1 ± 3,2 50,1 ± 5,2 62,6 ± 6,7 87,9 ± 4,5 Naringin 0,5 ± 0,7 4,6 ± 1,0 13,5 ± 1,3 24,3 ± 1,6 42,3 ± 4,5 Naringenin 4,4 ± 0,6 12,0 ± 0,4 28,0 ± 4,0 52,6 ± 2,9 68,2 ± 3,8 -Tocopherolb 3,7 ± 2,0 14,1 ± 3,7 32,0 ± 5,9 65,4 ± 6,5 99,8 ± 0,3 Rutinb 9,7 ± 1,8 17,9 ± 2,0 42,2 ± 1,3 48,8 ± 1,9 63,3 ± 7,3 a
Giá trị đƣợc hiểu là (%) lƣợng gốc tự do đƣợc dọn, đƣợc biểu diễn bởi trung bình ± SD từ 3 lần làm thí nghiệm khác nhau. b Chất đối chiếu.
5.4. Bàn luận
Qua các phép thử chống oxy hóa của citroflavonoid phân lập đƣợc từ vỏ quả của các loài Citrus cho thấy các flavonoid hesperetin, naringenin, hesperidin, naringin đều có tác dụng chống oxy hóa tốt. Các citroflavonoid có tác dụng dọn gốc tự do tổng hợp hóa học DPPH, dọn gốc tự do (có trong cơ thể sống) superoside (O2-●) và hydroxyl (OH●). Các citroflavonoid có tác dụng chống oxy hóa lipid, thể hiện ở tác dụng chống oxy hóa lipid tách từ não chuột và
lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL). Bảng 15 tổng hợp lại các tác dụng của các chất theo giá trị IC50, là giá trị thƣờng đƣợc sử dụng để so sánh tác dụng của các chất.
Bảng 15. Tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập đƣợc
Mẫu thử Tác dụng dọn gốc tự do
(IC50, g/ml)
Tác dụng chống oxy hóa lipid
(IC50, g/ml) DPPH OH● O2-● ILP ILDL Hesperidin 15,15 ± 4,67 4916 ± 446 11,36 ± 2,27 47,16 ± 5,34 14,88 ± 3,66 Hesperetin 3,88 ± 0,40 2463 ± 261 3,28 ± 0,65 14,99 ± 2,50 4,32 ± 1,21 Naringin 12,76 ± 2,81 >5000 >50 196,99 ± 65,12 >20 Naringenin 4,25 ± 0,25 4057 ± 952 15,88 ± 1,37 82,42 ± 19.26 10,06 ± 1,68 -Tocopherol 4,38 ± 0,22 - - 16,50 ± 3,01 5,74 ± 0,83 Rutin 5.10 ± 0.51 3119 ± 935 3,89 ± 0,79 44,72 ± 4,20 10,12 ± 2,61 Cơ chế chủ yếu của tác dụng chống oxy hóa lipid là tác dụng dọn gốc tự do [49], [50]. Tác dụng dọn gốc tự do của citroflavonoid là có thể dọn gốc tự do trực tiếp gây ra sự oxy hóa lipid, đặc biệt là gốc hydroxy (OH●). Các citroflavonoid cũng có thể dọn các gốc đƣợc tạo thành trong quá trình oxy hóa (L●, LO●, LOO●) và do đó dập tắt quá trình oxy hóa lipid. Một cơ chế khác là flavonoid có thể tạo phức với kim loại [49], [50]. Trong cơ thể, gốc tự do đƣợc tạo ra có thể do phản ứng của kim loại với các tác nhân dễ oxy hóa nhƣ H2O2, O2... Các citroflavonoid tạo phức với kim loại để làm giảm tác dụng tạo ra gốc tự do và do đó, làm giảm khả năng oxy hóa lipid.