2. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG
2.1.2.Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
a) Cách tiến hành Pha tĩnh
Bản mỏng silica gel GF254 (bản mỏng đã đƣợc tráng sẵn của Merck).
Pha động (dung môi khai triển)
Gồm các hệ dung môi sau:
Hệ A: n-Hexane-EtOAc-Acid acetic (6:3:1)
Hệ B: Toluen-EtOAc-Aceton-Acid formic (5:2:2:1) Hệ C: EtOAc-MeOH-Aceton-H2O (10:1:1:1) Hệ D : BuOH-Acid acetic-H2O (4:1:1)
Dung dịch thử
Lấy 1 gam bột dƣợc liệu cho vào bình nón, thêm 20 ml methanol (MeOH) rồi đun hồi lƣu cách thủy trong 20 phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc đƣợc để làm các phép định tính.
Dung dịch đối chiếu: các dung dịch naringin, hesperidin, naringenin, và hesperetin chuẩn trong
MeOH (khoảng 1 mg/ml).
Chấm chất phân tích lên bản mỏng
Lƣợng mẫu cần đƣa lên bản mỏng là khoảng 0,001 ml dung dịch đã pha ở trên. Chấm các vết trên một đƣờng xuất phát cách mép dƣới của bản mỏng 1,5cm. Các vết chấm có đƣờng kính khoảng 3-5 mm, cách nhau 15 mm, hai vết ngoài cùng cách mỗi mép ngoài của bản mỏng khoảng 1 cm.
Triển khai sắc ký
Ðặt bản mỏng gần nhƣ thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển (cách khoảng 5 mm). Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ thƣờng, không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng đƣợc một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết bằng cách phun dung dịch AlCl3 2% trong ethanol.
Kết quả là các sắc ký đồ TLC của các hoạt chất kể trên và các giá trị hệ số di chuyển Rf của các chất (đƣợc tính bằng tỉ số giữa quãng đƣờng đi đƣợc của chất cần phân tích và quãng đƣờng pha động đi đƣợc) [45].
b) Kết quả
Tiến hành sắc ký với 4 hoạt chất naringin (ký hiệu là chất số 1), hesperidin (2), naringenin (3) và hesperetin (4). Qua nhiều thăm dò chúng tôi đã chọn đƣợc các hệ dung môi triển khai lần lƣợt là A, B, C, và D nhƣ trình bày ở trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Kết quả thu đƣợc kết quả các sắc ký đồ đƣợc nhƣ các hình chụp dƣới đây (Hình 9) và có giá trị Rf của các chất đƣợc tính toán theo kết quả:
Hệ A: Rf (1) = Rf (2) = 0,01; Rf (3) = Rf(4) = 0,55 Hệ B: Rf (1) = Rf (2) = 0,07; Rf (3) = Rf(4) = 0,61 Hệ C: Rf (1) = 0,21; Rf (2) = 0,20; Rf (3) = Rf (4) = 0,75 Hệ D: Rf(1) = 0,69; Rf(2) = 0,67; Rf(3) = Rf(4) = 0,92
Hình 9. Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus
Từ kết quả thu đƣợc có thể thấy với hệ dung môi A và B sẽ cho hệ số Rf của hai glycosid 1 và 2 rất nhỏ (< 0,1) vì chúng là các chất phân cực, do đó dùng các hệ này để định tính hai glycosid này là không phù hợp. Cũng với hệ dung môi A và B cho giá trị Rf của hai aglycon của 1 và 2, lần lƣợt là narigenin (3) và hesperitin (4) bằng nhau (Rf lần lƣợt là 0,55 và 0,61) và giá trị nằm trong khoảng cho phép để định tính tốt. Với hệ C cho Rf của hai glycosid naringin và hesperidin thấp (Rf ~ 0,20) nhƣng cũng có thể sử dụng để định tính, giá trị Rf của hai chất 3 và 4 là 0,75 cũng phù hợp để có thể định tính bằng phƣơng pháp TLC. Trong khi ở hệ D thì giá trị Rf của chất 1 (0,69) và 2 có (0,67) thể sử dụng đƣợc thì Rf của 3 và 4 (đều là 0,92) không phù hợp cho định tính bằng TLC. Từ kết quả trên có thể thấy để định tính hai flavonoid glycosid 1 và 2 ta có thể sử dụng các hệ dung môi C và D, trong khi 3 hệ A, B, và C có thể sử dụng để chạy sắc ký cho hai chất 3 và 4.
Áp dụng để định tính các hoạt chất này trong các mẫu Citrus, chúng tôi tiến hành thí
nghiệm thử với một số loài Citrus có nhiều ở Việt Nam bằng các hệ dung môi đã lựa chọn ở
trên. Các hình dƣới đây (Hình 10 A, B, C, D) là kết quả định tính các hoạt chất có trong các mẫu Citrus thu hái đƣợc. Qua sắc ký đồ thấy rất rõ các glycoside 1 và 2 có chứa nhiều trong các mẫu Citrus, đặc biệt là bƣởi (vết 5), cam sành (vết 6), chanh (vết 7) và quýt (vết 10). Trong khi đó hai aglycon của chúng là naringenin và hesperitin đều có rất ít trong các mẫu, đa số là không phát hiện đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng.
Hình 10. Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus
Vết 1: naringin; vết 2: hesperidin; vết 3: naringenin; vết 4: hesperitin; vết 5: bƣởi, vết 6: cam sành; vết 7: chanh; vết 8: phật thủ; vết 9: quất; vết 10: quýt.
c) Kết luận
Bốn hệ dung môi A, B, C, D có thể sử dụng để định tính các chất naringin (1), hesperidin (2), naringenin (3), và hesperitin (4) bằng sắc ký lớp mỏng TLC. Kết quả này sẽ đƣợc áp dụng để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả các loài Citrus và sản phẩm của qui trình chiết xuất đƣợc trình bày trong các chuyên đề sau.