9. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM
9.2. Tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bột citroflavonoid
9.2.1. Nguyên vật liệu
- Bột citroflavonoid là chế phẩm đƣợc điều chế từ dƣợc liệu trần bì ở qui mô pilot, có tên khoa học Citrus reticulata Blanco, họ Cam (Rutaceae) ở 6 lô mẻ sản xuất khác nhau.
- Dung môi dùng: methanol (MeOH); ethanol (EtOH); acetonnitril (ACN); nƣớc cất (H2O)...dùng cho phân tích.
- Chất chuẩn phòng thí nghiệm hesperidin đƣợc cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng.
9.2.2. Thực nghiệm
Xây dựng tiêu chuẩn cho bột citroflavonoid dựa trên các chỉ tiêu chung đƣợc qui định tại dƣợc điển Việt Nam IV gồm: Mô tả, soi bột, vi phẫu, độ ẩm dƣợc liệu, tro toàn phần, tro không tan trong acid, định tính (Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng hiệu năng cao – HPTLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC, định lƣợng (Phƣơng pháp HPLC)…
9.2.3. Kết quả
a) Mô tả
Bằng cảm quan ta thấy: bột citroflavonoid là chế phẩm có màu trắng ngà, không vị, mùi đặc trƣng của dƣợc liệu.
b) Độ ẩm
Tiến hành xác định độ ẩm của các mẫu dƣợc liệu ở 6 lô mẻ khác nhau kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 27.
Bảng 27. Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu citroflavonoid
TT Tên mẫu Độ ẩm (%) 1 M1 4,86 2 M2 4,27 3 M3 4,91 4 M4 5,02 5 M5 5,21 6 M6 4,99 Trung bình 4.87
Độ ẩm của các mẫu bột nằm trong khoảng từ 4,27% đến 5,21%, trung bình 4,87%. Theo qui DĐVN IV độ ẩm của cao khô không đƣợc quá 5%, Vì vậy giới hạn độ ẩm cho chế phẩm bột citroflavonoid qui định không đƣợc quá 5,0%
c) Tro toàn phần
Bảng 28. Kết quả tro toàn phần của các mẫu citroflavonoid
TT Tên mẫu Tro sulfat (%)
1 M1 1,58% 2 M2 0,78% 3 M3 1,63% 4 M4 2,57% 5 M5 0,69% 6 M6 1,66% Trung bình 0,92%
Kết quả cho thấy tro toàn của 6 mẻ chiết xuất khác nhau nằm trong khoảng từ 0,69 đến 2,57%, trung bình 1,485%. Chúng tôi đƣa ra giới hạn tro toàn phần của bột citroflavonoid không đƣợc quá 3,0%, phù hợp với qui định của Dƣợc điển Việt Nam IV.
d) Định tính
* Phương pháp sắc ký bản mỏng: Quan sát dƣới UV366nm, Sắc ký đồ của dung dịch thử có
một vết chính Rf 0,4-0,5 có cùng màu và cùng Rf với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu hesperidin (Hình 30).
Hình 30. Sắc ký đồ TLC định tính bột citroflavonoid
(Ký hiệu: H: hesperidin đối chiếu; Vết 1-6: các mẫu bột citroflavonoid)
* Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tiến hành tiêm các mẫu thử, chuẩn vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó lựa chọn ở phần định lƣợng, ghi sắc ký đồ (SKĐ) của các mẫu kết quả mẫu thử phải cho pic có thời gian lƣu và phổ UV trùng với thời gian lƣu và phổ UV của pic hesperidin trong mẫu chuẩn (Hình 31).
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 m AU 0 50 100 150 200 250 300 350 400 m AU 0 50 100 150 200 250 300 350 400 43285 5428515704104868 203660 111778 284517 8189481 66059 2112 19627 3413 5630 136 110 313231714115 5278 80499 20991066 15973251168 406 2070 1209 4: 280 nm, 8 nm Hesperidin
Hesperidin-Aldric- C1(0.249mg.ml) -06092011 - 10uL - 003.dat
Area
SKĐ HPLC hesperidin đối chiếu
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 m AU -25 0 25 50 75 100 125 150 175 m AU -25 0 25 50 75 100 125 150 175 81743 370374 165282 60345 456528 3719844 168787 4: 280 nm, 8 nm Citrus
Hesperidin-Citrus- M-1-2 (0.20mg.ml) -12092011 - 10uL - 003.dat
Area
SKĐ HPLC bột citroflavonoid
Spectrum at time 7.55 min.
nm 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 7.55 min Lambda max : 200 283 327 Lambda min : 318 248 Phổ UV của hesperidin
Hình 31. Sắc ký đồ HPLC của hesperidin đối chiếu và mẫu bột citroflavonoid
e) Định lượng
Tiến hành định lƣợng hesperidin 6 lô mẻ chiết xuất, kết quả hàm lƣợng hesperidin đƣợc trình bày tại Bảng 29.
Bảng 29. Hàm lƣợng % hesperidin trong các mẫu bột citroflavonoid
TT Tên mẫu Hàm lƣợng % hesperidin tính theo
khối lƣợng khô tuyệt đối
1 M1 60,01 2 M2 54,80 3 M3 60,08 4 M4 47,30 5 M5 58,30 6 M6 56,83 Trung bình 56,21
Hàm lƣợng hesperidin của các mẫu bột nằm trong khoảng từ 47,30% đến 60,08%, trung bình 56.21%. Vì vậy giới hạn hesperidin cho chế phẩm citroflavonoid qui định không đƣợc thấp hơn 50,0% là phù hợp.
f) Độ nhiễm khuẩn
Tiến hành thử độ nhiễm khuẩn của 6 mẻ chế phẩm bột citroflavonoid, kết quả đều đạt mức 4, theo yêu cầu của DĐVN IV (đối với thuốc uống ).
9.2.4. Kết luận
Từ những khảo sát trên chúng tôi đã xây dựng đƣợc Tiêu chuẩn cơ sở cho bột citroflavonoid và đã đƣợc Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng thẩm định (xem Phụ lục).
10. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP CỦA BỘT CITROFLAVONOID 10.1. Nguyên vật liệu
- Mẫu thử: bột citroflavonoid là sản phẩm của qui trình chiết xuất, đạt tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng.
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống (đực và cái), trọng lƣợng 18-22 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.
10.2. Thực nghiệm
Độc tính cấp đƣợc thử theo phƣơng pháp Lichtfield-Wilcoxon, có cải tiến theo một số tác giả trong nƣớc nhƣ đã mô tả trong phần Phƣơng pháp.
10.3. Kết quả
Chuột đƣợc cho uống bột citroflavonoid với các liều khác nhau, từ thấp đến cao. Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện trong Bảng 30. Chuột uống bột citroflavonoid với các liều 14g, 17 g, 22 g và 28 g bột/kg thể trọng vẫn khỏe mạnh, hoạt động ăn uống bình thƣờng. Liều 28 g bột/kg thể trọng là liều tối đa có thể cho một con chuột nhắt trắng uống trong 1 ngày (nồng độ và thể tích tối đa cho phép) mà chuột vẫn khỏe mạnh bình thƣờng. Nhƣ vậy, không xác định đƣợc LD50 và LD100 của sản phẩm bột citroflavonoid trên chuột nhắt trắng theo đƣờng uống.
Quan sát tiếp 7 ngày sau khi dừng thuốc cũng không thấy có dấu hiệu ngộ độc nào ở tất cả các lô.
Nếu xem liều uống viên Daflon là 500 mg, uống 4-6 viên/ngày, tức là tối đa 3 g hoạt chất/ngày cho ngƣời bình thƣờng là 50 kg, thì liều sử dụng sẽ là 150 mg/kg/ngày. So sánh với liều thử tối đa 28 g/kg trên chuột cho ta thông tin là sản phẩm có độ an toàn cao.
Nhƣ vậy, sản phẩm bột citroflavonoid thu đƣợc từ qui trình chiết xuất ở qui mô pilot có độ an toàn cao về độc tính cấp. Điều này cho phép các tác giả tiếp tục tiến hành thử độc tính bán trƣờng diễn để xác định độ an toàn khi dùng sản phẩm.
Bảng 30. Số liệu thử độc tính cấp của citroflavonoid
Thứ tự lô
Liều uống (g bột/ kg thể trọng)
Số chuột trong 1 lô Số chuột chết
1 5 10 0 2 10 10 0 3 14 10 0 4 17 10 0 5 22 10 0 6 28 10 0