4. PHÂN LẬP CÁC CITROFLAVONOID CHÍNH LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU
4.2.1.Phân lập Naringin (ký hiệu là CF-1)
a) Nguyên liệu
Dƣợc liệu để chiết xuất và phân lập flavonoid naringin là vỏ quả bƣởi Diễn (C. grandis) đƣợc thu mua tại Hà Nội, đƣợc sấy khô ở 60 oC cho đến độ ẩm < 10%. Vỏ bƣởi (đã loại bỏ phần vỏ ngoài màu xanh chứa tinh dầu) đƣợc cắt thành miếng nhỏ dài khoảng 3-4 cm, rộng khoảng 0,5-1cm. Bảo quản nguyên liệu trong túi polymer, để nơi khô thoáng, tránh ẩm.
b) Chiết xuất và tinh chế naringin
Qua khảo sát (xem báo cáo Chuyên đề), chúng tôi nhận thấy phƣơng pháp chiết bằng EtOH 90% cho hiệu suất chiết xuất cao nhất, sản phẩm thu đƣợc là dạng bột kết tinh sáng màu hơn, thời gian kết tinh cũng nhanh hơn. Dƣợc liệu ở dạng cùi vỏ trắng sẽ cho hiệu suất thu đƣợc sản phẩm cao hơn, sản phẩm kết tinh đẹp hơn so với chiết từ vỏ quả xanh. Tiến hành chiết xuất naringin (Hình 14) thu đƣợc naringin thô.
Tinh chế naringin nhƣ sau: hòa tan 5 g flavonoid thô trong 350 ml hỗn hợp cồn 96%- nƣớc tỷ lệ 1:3. Thêm 0,5 g than hoạt đun nóng khoảng 5 phút để loại màu. Để nguội rồi lọc loại than hoạt. Dịch lọc để lạnh (< 10 oC) trong 24-48 giờ, lọc lấy tinh thể, rửa bằng nƣớc cất lạnh và kết tinh lại 2 lần nữa. Để khô tinh thể ở nhiệt độ phòng rồi sấy ở 60 oC cho đến khối lƣợng không đổi cân đƣợc 4,01 g. Hiệu suất tinh chế là: 80,2%. Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC cho thấy naringin phân lập đƣợc có độ tinh khiết là 95,5% (>95%).
Chất CF-1: tinh thể hình kim không màu; nhiệt độ nóng chảy 166-167 oC; Phổ UV (trong MeOH) λmax 282, 327 nm; Phổ IR (viên nén KBr): νmax cm-1: 3425 (OH), 2926 (C−H), 1641 (C=O), 1588, 1516, 1452 (C=C), 1295, 1179, 1132, 1043 (C−O). Phổ 1
H và 13C NMR: xem Bảng 8; Phổ ESIMS: m/z 581 [M + H]+.
Hợp chất CF-1 thu đƣợc dƣới dạng kết tinh không màu, tan tốt trong MeOH, EtOH, có tan vừa trong H2O. Tinh thể có nhiệt độ nóng chảy là 166-167 oC, và có năng suất quay cực âm trong MeOH ([]25
D).Chất thu đƣợc đem kiểm tra bằng SKLM thấy có giá trị Rf trùng với naringin chuẩn nên sơ bộ xác định là naringin.
Phổ UV của chất CF-1 cho các điểm hấp thụ cực đại tại các bƣớc sóng 282 nm và 327 nm, là đặc trƣng của flavonoid. Phổ ESIMS: m/z 581 [M + H]+
tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử 580 (công thức phân tử là C27H32O14). So sánh các dữ liệu phổ UV, IR, 1H NMR, 13C NMR, MS với các số liệu đã đƣợc công bố của naringin [59], [60] chúng tôi đi đến kết luận chất số
CF-1 chính là naringin (Hình 15).
d) Kết luận
Nhóm nghiên cứu đã phân lập và tinh chế đƣợc naringin có độ tinh khiết 95,5% (>95%), có thể sử dụng làm chất đối chiếu cho phân tích, tiêu chuẩn dƣợc liệu và thử tác dụng sinh học cho các thí nghiệm về sau. Hiện tại, nhóm nghiên cứu đã phân lập và tinh chế đƣợc 3,2 g naringin tinh khiết, lớn hơn số lƣợng đăng ký trong thuyết minh của đề tài (500 mg naringin hàm lƣợng > 95%).