II. Mục ựắch và yêu cầu của ựề tài
3.4.6. Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
3.4.6.1 Phương pháp tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase cao
để tuyển chọn các chủng nấm mốc: sử dụng môi trường khoáng Czapek- Dox thay nguồn carbon bằng 1% lõi ngô, thanh trùng ở 1210C, 1 atm trong 20 phút. để nguội, bổ sung giống, nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 300C, kiểm tra hoạt tắnh xylanase sau 3 ngày nuôi cấy lắc bằng phương pháp DNS.
* Phương pháp bảo quản giống
Sử dụng phương pháp cấy truyền ựịnh kỳ và bảo quản ở nhiệt ựộ thấp ựể giữ giống.
Giống ựược cấy truyền và bảo quản trong môi trường MT1. Các thao tác ựược tiến hành trong tủ cấy vô trùng.
Nuôi cấy giống Aspergillus niger ở 300C trong 3 ngày, sau ựó ựưa ựi nhân giống tiếp tục hoặc bảo quản ở nhiệt ựộ 3 - 50C nhằm hạn chế sự phát triển và sinh trưởng của vi sinh vật, tránh thoái hoá giống. Cứ 1 - 2 tháng cấy truyền ựịnh kỳ một lần.
* Phương pháp nhân giống
Môi trường nhân giống là môi trường MT2. Môi trường này ựược vô trùng ở 1150C trong 20 phút. Chủng giống ựược cấy vào các bình tam giác 500ml với 200ml thể tắch thực. Nuôi trong tủ ấm 300C trong 3 ngày.
3.4.6.2. Xác ựịnh một số ựiều kiện (nhiệt ựộ, pH, dinh dưỡng,Ầ) ựể sinh tổng hợp enzyme xylanase ựạt hiệu quả cao
3.4.6.2.1. Thắ nghiệm 1: ảnh hưởng của nhiệt ựộ sinh tổng hợp enzyme xylanase ựạt hiệu quả cao
Tiến hành nuôi cấy chủng A. niger NVT3 trên môi trường dịch lõi ngô (2%), ở các ngưỡng nhiệt ựộ khác nhau trong khoảng 26; 28; 30; 32; 340C.
3.4.6.2.2. Thắ nghiệm 2: ảnh hưởng của pH sinh tổng hợp enzyme xylanase
ựạt hiệu quả cao
Tiến hành nuôi cấy chủng A. niger NVT3 trên môi trường dịch lõi ngô (2%) ựể sinh tổng hợp enzyme xylnase có pH ban ựầu ở các ngưỡng khác nhau từ 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0.
3.4.6.2.3. Thắ nghiệm 3: Ảnh hưởng của nguồn nitơ ựến khả năng sinh tổng hợp xylanase
Tiến hành thắ nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau ở tỷ lệ 1% trong dịch thủy phân ựến khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng A. niger NVT3, với pH = 6,0 và nhiệt ựộ lên men là 300C
3.4.6.2.4. Thắ nghiệm 4: Xác ựịnh nguồn và nồng ựộ nitơ vô cơ ựến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase
Bố trắ thắ nghiệm với 3 nguồn nitơ vô cơ là NaNO3, KNO3, NH4NO3 ở nồng ựộ: 0,5%; 0,7%; 0,8%; 0,9%; 1,0%; 1,1%; 1,2%; 1,3%.
3.4.6.3 Nghiên cứu ựiều kiện thu hồi enzyme xylanase quy mô phòng thắ nghiệm
* Phương pháp tách chiết enzyme tủa chế phẩm thô
Lấy 5g chế phẩm bổ sung 50 ml nước có bổ sung Tween 80, ựồng nhất và ựặt vào máy lắc tốc ựộ 180 vòng trong 60 phút ở nhiệt ựộ 280C. Sau ựó lọc dịch trong và ựem kết tủa.
* Phương pháp tách chiết enzyme bằng dung môi
Bố trắ thắ nghiệm gồm 6 loại dung môi và tỷ lệ dịch enzyme khác nhau: Etanol (1:1), Etanol (1:3), Aceton(1:1), Aceton(1:2),Sunfat amon(75%),
Sunfatamon (95%)
* Phương pháp kết tủa enzyme bằng sunfat amôn
Khi ựưa muối sunfat amôn vào dung dịch chiết enzyme thì làm thay ựổi lực tĩnh ựiện và các tương tác kỵ nước của enzyme và dẫn ựến sự mất cân bằng và các phân tử protein kết lắng xuống. Nghiền sunfat amôn và bổ sung dần dần có khuấy liên tục.
* Phương pháp thẩm tắch:
Thẩm tắch là quá trình tách các phân tử lượng thấp qua màng bán thấm. điều kiện cần có ựể thẩm tắch là tạo ựược sự chênh lệch về nồng ựộ giữa bên trong và bên ngoài màng. điều này có thể thực hiện ựược nếu một mặt của màng là nước còn mặt kia là dung dịch thẩm tắch. Khi ựó các chất có khối lượng phân tử thấp có mặt trong dung dịch sẽ khuếch tán qua các lỗ của màng và tách ra cùng với nước, như vậy gọi là thẩm tắch. Sẽ có hiện tượng làm mất hoạt tắnh của enzyme gắn không bền chặt với các nhóm chức hay là các ion kim loại ở trung tâm hoạt ựộng dễ bị rửa trôi. Sauk hi thẩm tắch, hoạt ựộ có thể giảm. tỷ lệ dung dịch thẩm tắch và nước là 1:50. Lượng các tạp chất loại bỏ sau 20 giờ giảm 3,5-4 lần.
3.4.6.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và nhiệt ựộ ựến ựộ bền của enzyme xylanase
- Xác ựịnh hoạt tắnh của xylanase.
Hoạt tắnh của xylanase ựược xác ựịnh theo phương pháp của Bailey và cs. ựề xuất năm 1992.[30]
Nguyên lý: Xylanase (endoxylanase 1,4-β xylanase) có khả năng phân cắt cơ chất xylan thành các oligoxylose và xylose có tắnh khử và có khả năng bắt màu vàng cam ựặc trưng với thuốc thử DNS khi ựun nóng.
Dựng ựường chuẩn D-xylose: Thành phần hỗn hợp phản ứng bao gồm 50 ộl dung dịch D-xylose trong ựệm Na-acetate ở các nồng ựộ lần lượt là 0; 2; 4; 6; 8; 10 (ộmol/ml) + 450 ộl dung dịch OSX 1% (Oat spelts xylan) + 750 ộl dịch thử DNS. đun nóng trong 5 phút, sau ựó làm lạnh và ựo ựộ hấp phụ OD ở bước song λ= 540 nm. đường chuẩn xylose ựược dựng nhờ chương trình Microsoft Excel. Phương trình thể hiên mối tương quan giữa D-xylose và OD540nm là: y = 11.653x + 0.197. Trong ựó y là hàm lượng xylose trong 1 ml dich, x là giá trị OD540nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0.995 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là chặt chẽ.
Mẫu thắ nghiệm: 50 ộl dung dịch enzyme + 450 ộl xylan ựể phản ứng trong 5 phút ở 50oC, dừng phản ứng bằng 0.75 ml dung dịch DNS, ựun nóng trong nước sôi trong 5 phút. Mỗi mẫu thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần.
Mẫu ựối chứng (blank): 50 ộl nước + 450 ộl xylan ựể phản ứng trong 5 phút ở 50oC, dừng phản ứng bằng 0.75 ml dung dịch DNS, ựun nóng trong nước sôi trong 5 phút.
Sau phản ứng ựường khử ựược giải phóng dưới tác dụng của enzyme ựược xác ựịnh bằng thuốc thử DNS, ựộ hấp thụ của sản phẩm ựược ựo bằng máy ựo quang phổ ở λ = 540 nm. Từ giá trị OD ta tắnh ựược lượng ựường khử tạo ra nhờ phương trình ựường chuẩn y = 11.653x + 0.197.
Quy ước: Một ựơn vị hoạt ựộ của xylanase là lượng enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ựể giải phóng ra 1 ộmol ựường khử trong thời gian 1 phút.
3.4.6.3.2.Thắ nghiệm 5: Xác ựịnh pH hoạt ựộng tối ưu của xylanase.
Bố trắ thắ nghiệm gồm 12 công thức ở ngưỡng pH: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0. Phản ứng ựược xảy ra trong 50 mM dung dịch ựệm.
3.4.6.3.3 Thắ nghiệm 6: Xác ựịnh ựộ bền pH của xylanase:
Bố trắ thắ nghiệm gồm 12 công thức ở ngưỡng pH: 2,5; 3,0;3,5;4,0;4,5; 5,0; 5,5; 6,0;6,5; 7,0; 7,5; 8,0. Phản ứng xảy ra trong 50mM dung dịch ựệm.
để xác ựịnh ựộ bền pH của xylanase, enzyme ựược ủ trong các dung dịch ựệm (50 mM) khác nhau có dải pH 2.5-8.0 (bước nhảy pH là 0.5) theo tỉ lệ 1:4 ở nhiệt ựộ 4oC trong 120 phút. Xác ựịnh hoạt còn lại (%) của dịch enzyme ựã xử lý so với ựối chứng là hoạt lực của dịch enzyme giữ ở pH tối ưu (100%).
3.4.6.3.4.Thắ nghiệm 7: Xác ựịnh nhiệt ựộ hoạt ựộng tối ưu của xylanase:
Bố trắ thắ nghiệm gồm 13 công thức ngưỡng nhiệt ựộ: 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 800C.
Nhiệt ựộ hoạt ựộng tối ưu của xylanase ựược xác ựịnh bằng cách tiến hành phản ứng enzyme-cơ chất trong pH tối ưu ở dải nhiệt ựộ từ 20-80oC (bước nhảy là 5oC).
3.4.6.3.5 Thắ nghiệm 8: Xác ựịnh ựộ bền nhiệt của xylanase
để xác ựịnh ựộ bền nhiệt của xylanase, enzyme ựược ủ trong 50 mM dung dịch ựệm Na-acetate (ở pH 5.5) ở dải nhiệt ựộ từ 20-80oC (bước nhảy là 10oC) trong 120 phút. đường khử ựược giải phóng dưới tác dụng của enzyme ựược xác ựịnh bằng thuốc thử DNS. Xác ựịnh hoạt lực hoạt lực còn lại (%) của dịch enzyme ựã xử lý so với ựối chứng là hoạt lực của dịch enzyme giữ ở pH tối ưu (100%) [5].
3.4.7. Nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase ựể thu nhận ựường xylose từ xy lan quy mô phòng thắ nghiệm