II. Mục ựắch và yêu cầu của ựề tài
3.4.5. Phương pháp tách chiết eyme xylanase
3.4.5.1 phương pháp xác ựịnh hoạt tắnh của xylanase
Hoạt tắnh của xylanase ựược xác ựịnh theo phương pháp của Bailey và cs. ựề xuất năm 1992. [28]
Nguyên lý: Xylanase (endoxylanase 1,4-β xylanase) có khả năng phân cắt cơ chất xylan thành các oligoxylose và xylose có tắnh khử và có khả năng bắt màu vàng cam ựặc trưng với thuốc thử DNS khi ựun nóng.
Dựng ựường chuẩn D-xylose: Thành phần hỗn hợp phản ứng bao gồm 50 ộl dung dịch D-xylose trong ựệm Na-acetate ở các nồng ựộ lần lượt là 0; 2; 4; 6; 8; 10 (ộmol/ml) + 450 ộl dung dịch OSX 1% (Oat spelts xylan) + 750 ộl dịch thử DNS. đun nóng trong 5 phút, sau ựó làm lạnh và ựo ựộ hấp phụ OD ở bước song λ= 540 nm. đường chuẩn xylose ựược dựng nhờ chương trình Microsoft Excel. Phương trình thể hiên mối tương quan giữa D-xylose và OD540nm là: y = 11.653x + 0.197. Trong ựó y là hàm lượng xylose trong 1 ml dich, x là giá trị OD540nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0.995 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là chặt chẽ.
Mẫu thắ nghiệm: 50 ộl dung dịch enzyme + 450 ộl xylan ựể phản ứng trong 5 phút ở 50oC, dừng phản ứng bằng 0.75 ml dung dịch DNS, ựun nóng trong nước sôi trong 5 phút. Mỗi mẫu thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần.
Mẫu ựối chứng : 50 ộl nước + 450 ộl xylan ựể phản ứng trong 5 phút ở 50oC, dừng phản ứng bằng 0.75 ml dung dịch DNS, ựun nóng trong nước sôi trong 5 phút.
Sau phản ứng ựường khử ựược giải phóng dưới tác dụng của enzyme ựược xác ựịnh bằng thuốc thử DNS, ựộ hấp thụ của sản phẩm ựược ựo bằng máy ựo quang phổ ở λ = 540 nm. Từ giá trị OD ta tắnh ựược lượng ựường khử tạo ra nhờ phương trình ựường chuẩn y = 11.653x + 0.197.
Quy ước: Một ựơn vị hoạt ựộ của xylanase là lượng enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ựể giải phóng ra 1 ộmol ựường khử trong thời gian 1 phút.
3.4.5.2 Phương pháp tách và tinh sạch enzyme xylanase
* Phương pháp tách chiết enzyme tủa chế phẩm thô
Lấy 5g chế phẩm bổ sung 50 ml nước có bổ sung Tween 80, ựồng nhất và ựặt vào máy lắc tốc ựộ 180 vòng trong 60 phút ở nhiệt ựộ 280C. Sau ựó lọc dịch trong và ựem kết tủa.
* Phương pháp tách chiết enzyme bằng dung môi
đối với phần lớn các enzyme cần làm tủ ở nhiệt ựộ thấp. Ở ựiều kiện nhiệt ựộ cao có thể dẫn ựến vô hoạt enzyme. Etanol cần làm lạnh ở 1-20C trước khi ựem sử dụng. Khi sử dụng dung môi ựể kết tủa có thể dẫn ựến sự bất hoạt enzyme. Các phân tử protein sẽ có hoạt tắnh khi còn giữ nguyên cấu trúc không gian nhất ựịnh, khi các gốc phân cực phân bố ựều trên bề mặt phân tử protein và các gốc kỵ nước không phân cực thì nằm trong long phân tử. Khi có mặt các dung môi hữu cơ thì hằng số ựiện môi của môi trường giảm, phân tử protein có thể tạo thành dạng không có hoạt tắnh do bị phá vỡ cấu trúc. Hiện tượng này xảy ran gay cả ở nhiệt ựộ phòng. Vì vậy cần tiến hành ở nhiệt ựộ thấp từ 0-20C.
* Phương pháp kết tủa enzyme bằng sunfat amôn
Khi ựưa muối sunfat amôn vào dung dịch chiết enzyme thì làm thay ựổi lực tĩnh ựiện và các tương tác kỵ nước của enzyme và dẫn ựến sự mất cân bằng và các phân tử protein kết lắng xuống. Nghiền sunfat amôn và bổ sung dần dần có khuấy liên tục.
* Phương pháp thẩm tắch:
Thẩm tắch là quá trình tách các phân tử lượng thấp qua màng bán thấm. điều kiện cần có ựể thẩm tắch là tạo ựược sự chênh lệch về nồng ựộ giữa bên trong và bên ngoài màng. điều này có thể thực hiện ựược nếu một mặt của
màng là nước còn mặt kia là dung dịch thẩm tắch. Khi ựó các chất có khối lượng phân tử thấp có mặt trong dung dịch sẽ khuếch tán qua các lỗ của màng và tách ra cùng với nước, như vậy gọi là thẩm tắch. Sẽ có hiện tượng làm mất hoạt tắnh của enzyme gắn không bền chặt với các nhóm chức hay là các ion kim loại ở trung tâm hoạt ựộng dễ bị rửa trôi. Sauk hi thẩm tắch, hoạt ựộ có thể giảm. tỷ lệ dung dịch thẩm tắch và nước là 1:50. Lượng các tạp chất loại bỏ sau 20 giờ giảm 3,5-4 lần.