PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu thành phần và hoạt tính của enzyme tiêu hóa
2.2.2.1 Thu và phân tích mẫu enzyme
51
Hình 2.20. Sơ đồ thu và phân tích mẫu enzyme
Hình 2.21. Giải phẫu tôm hùm bông và tôm hùm xanh
Hình 2.22. Cấu tạo trong của phần đầu ngực của tôm hùm
2.2.2.2. Nghiên cứu thành phần và hoạt tính của enzyme tiêu hóa của tôm hùm bông và tôm hùm xanh
Nghiên cứu hoạt tính enzyme tiêu hóa protease, lipase, amylase
Ly tâm
Xác định hoạt tính protease, amylase, lipase Xay nhuyễn, nghiền mịn, thêm dung môi
Dịch enzyme
Tủa dịch chiết
Enzyme thô
Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel
Xác định hoạt tính protease, amylase, lipase Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme: nhiệt độ, pH
Xác định khối lượng phân tử bằng điện di SDS-PAGE Hệ thống tiêu hóa của tôm hùm sống
Xác định hoạt tính protease, amylase, lipase
52
Từ tôm hùm bông sống, tiến hành mổ lớp vỏ phần đầu và thân tôm. Tách hệ thống tiêu hóa tôm tránh lẫn phần gan tụy, tim. Nghiền hoặc xay hệ tiêu hóa tôm vào bằng cối chày. Trong quá trình xay cần giữ lạnh ở khoảng 40C để tránh biến tính enzyme.
Trích ly enzyme: phối trộn mẫu nguyên liệu đã xay nghiền với dung môi (đệm phosphate 0,1M pH 7,2) theo tỷ lệ mẫu/dung môi tối ưu là 1/3 11.
Giữ khoảng 4oC bằng đá vụn, khuấy liên tục trên máy khuấy từ trong 40 phút. Trong quá trình này enzyme trong tuyến tiêu hóa sẽ hòa tan và khuyếch tán vào dung môi. Tiến hành ly tâm lạnh ở 40C với tốc độ 9.000 rpm/10 phút mục đích loại bỏ tạp chất không tan có trong dịch enzyme và thu dịch ly tâm (dịch chiết).
Nguyên tắc và phương pháp xác định, đánh giá các chỉ tiêu:
- Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Lowry (Phụ lục 1).
- Hoạt độ protease được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến (Phụ lục 1).
- Hoạt độ amylase bằng phương pháp Heinkel (Phụ lục 1).
- Hoạt độ lipase được xác định bằng phương pháp chuẩn độ Cherry- Crandall (Phụ lục 1).
- Protein của protease, amylase, lipase trong dịch enzyme của tác nhân tủa cồn được tách bằng phương pháp sắc ký lọc gel (Phụ lục 1).
Hình 2.23. Trích ly enzyme trên máy khuấy từ và tủa enzyme sau khi ly tâm
53
Hình 2.24. Xác định hoạt độ protease và chuẩn độ đo hoạt tính lipase Thời gian thí nghiê ̣m từ 01/2013 – 04/2013.
2.2.2.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme tiêu hóa của tôm hùm
Bố trí thí nghiệm tương tự thí nghiệm nghiên cứu hoạt tính enzyme tiêu hóa protease, lipase, amylase.
Hòa tan lại enzyme và lấy dịch enzyme để xác định sự phụ thuộc hoạt độ protease, amylase, lipase vào hai yếu tố nhiệt độ và pH.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme:
Chế phẩm enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm ủ với casein 2%, pH 7,0 trong vòng 60 phút ở dãy nhiệt độ: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 và 90oC trên bể ổn nhiệt. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến và kết luận ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ của protease.
Chế phẩm enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm tác dụng với tinh bột 1%, pH 7,0 trong vòng 4 giờ ở dãy nhiệt độ: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 và 90oC trên bể ổn nhiệt. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel và kết luận ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ của amylase.
Chế phẩm enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm ủ với hệ nhũ tương dầu phộng, pH 7,0 trong vòng 2 giờ ở dãy nhiệt độ: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 và 90oC trên bể ổn nhiệt. Xác định hoạt độ lipase theo phương pháp chuẩn độ Chery- Crandall và kết luận ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ của lipase.
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme:
Mỗi enzyme có một khoảng pH hoạt động thích hợp và một giá trị pH tối ưu nhất. Chuẩn bị dung dịch đệm vạn năng (acid acetic, acid phosphoric, acid orth-boric) rồi hiệu chỉnh đến giá trị pH mong muốn bằng dung dịch NaOH.
54
Chế phẩm enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm ủ với casein 2%, trong vòng 60 phút ở dãy pH: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10 với dung dịch đệm. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến và kết luận ảnh hưởng pH tới hoạt độ của protease.
Chế phẩm enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm ủ với tinh bột 1% trong vòng 4 giờ ở dãy pH: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10 với dung dịch đệm. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heikel và kết luận ảnh hưởng pH tới hoạt độ của amylase.
Chế phẩm enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm ủ với hệ nhũ tương dầu phộng trong vòng 2 giờ ở dãy pH: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10 với dung dịch đệm. Xác định hoạt độ lipase theo phương pháp chuẩn độ Chery-Crandall và kết luận ảnh hưởng pH tới hoạt độ của lipase.
Thời gian thí nghiê ̣m từ 01/2013 – 04/2013.