PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2 Nội dung 2. Nghiên cứu thành phần và hoạt tính enzyme tiêu hóa của tôm hùm bông và tôm hùm xanh
3.2.2 Nghiên cứu thành phần và hoạt tính enzyme tiêu hóa của tôm hùm
Hoạt tính enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm xanh ở các bước tinh sạch của thí nghiệm
Kết quả thí nghiệm trình bày ở bảng 3.40, 3.41, 3.42
Bảng 3.40: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease hệ thống tiêu hóa tôm hùm xanh Các sản
phẩm
Tổng đơn vị hoạt độ
(U)
Tổng hàm lượng protein (mg)
Hoạt tính riêng (U/mg)
Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất (%) Dịch chiết
enzyme
836,05 584,65 1,43 1,00 100,00
Chế phẩm enzyme thô
726,68 328,20 2,21 1,54 86,92
Sau sắc ký 604,70 53,54 11,29 7,89 72,32
103
Bảng 3.41: Tóm tắt quá trình tinh sạch amylase hệ thống tiêu hóa tôm hùm xanh Các sản
phẩm
Tổng đơn vị hoạt độ
(U)
Tổng hàm lượng protein (mg)
Hoạt tính riêng (U/mg)
Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất (%) Dịch chiết
enzyme
331,11 649,25 0,51 1,00 100,00
Chế phẩm enzyme thô
209,56 214,60 0,97 1.90 63,29
Sau sắc ký 139,20 42,14 3,30 6,47 42,04
Bảng 3.42. Tóm tắt quá trình tinh sạch lipase hệ thống tiêu hóa tôm hùm xanh Các sản
phẩm
Tổng đơn vị hoạt độ
(U)
Tổng hàm lượng protein (mg)
Hoạt tính riêng (U/mg)
Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất (%) Dịch chiết
enzyme
580,29 542,33 1,07 1,00 100,00
Chế phẩm enzyme thô
200,50 128,12 1,56 1,45 34,55
Sau sắc ký 119,93 29,77 4,02 3,75 20,66
Kết quả cho thấy trong hệ tiêu hóa tôm hùm xanh có enzyme hoạt tính protease, amylase, lipase. Hoạt tính riêng của protease, amylase, lipase qua bước tính sạch đều tăng lên đáng kể (lần lượt là 7,89; 6,47 và 3,75 lần). Hoạt tính enzyme của chế phẩm thô hệ tiêu hóa tôm hùm xanh tăng lên rõ rệt so với dịch chiết vì quá trình tủa đã loại bớt được một số tạp chất và enzyme không thể hiện hoạt tính. Các protein lạ này sẽ bị loại bỏ tiếp tục qua quá trình sắc ký. Dựa trên nguyên tắc phân đoạn của sắc ký lọc gel với Bio-Gel P 100 cho phép thu được những phân tử protein trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 5.000 Da đến 100.000 Da. Protein-enzyme ra khỏi cột gel được đo hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng hệ thống detector trong hệ thống sắc ký và được thể thể hiện dạng sắc ký đồ bằng phần mền LP-Data View trên máy tính. Dựa vào sắc ký đồ chúng ta thu những phân đoạn dịch protein-enzyme của từng peak. Do đó, enzyme sau sắc ký loại bỏ hầu hết những tạp chất, protein có kích thước nằm ngoài giới hạn tách của Bio-Gel P 100 nên hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch cao nhất.
104
Sắc ký đồ tinh sạch enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm xanh
Kết quả tinh sạch enzyme hệ tiêu hóa qua các hình sắc ký đồ hình 3.11, 3.12, 3.13.
Hình 3.11. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC hệ thống tiêu hóa tôm hùm xanh
Hình 3.12. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch amylase với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC hệ thống tiêu hóa tôm hùm xanh
Đối với tôm hùm xanh, sắc ký đồ enzyme đều có hai đỉnh protein trở lên, trong đó sắc ký đồ protease có ba đỉnh protein rõ ràng, sắc ký đồ amylase có hai đỉnh protein rõ và lipase có ba đỉnh protein phân biệt. Tuy nhiên với cả ba loại enzyme thì protein chiếm ưu thế vẫn rơi ở đỉnh cuối cùng. Có thể rút ra kết luận là thành phần protein trong protease, amylase, lipase có nhiều loại với khối
105
lượng phân tử khác nhau. Tiến hành chạy điện đi SDS-PAGE để xác định trọng lượng phân tử các protein này.
Hình 3.13. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch lipase với Gel Sephadex G150 của CPT tủa cồn từ DC hệ thống tiêu hóa tôm hùm xanh
Xác định khối lượng phân tử điện di SDS – PAGE
Thang protein chuẩn có kích thước xác định sau: Myosin 209.000 Da, В- galactosidase 124.000 Da, BSA 80.000 Da, Ovalbumin 49.100 Da, Carbonic anhydrase 34.800 Da, Soybean trysin inhibitor 28.800 Da, Lysozyme 20.600 Da và Aprotinin 7.100 Da.
Bảng 3.43. Tính Rf và Log trọng lượng phân tử Thang chuẩn
(Rf)
Trọng lượng phân tử (Da)
Log trọng lượng phân tử (Lg MW)
0,029 209.000 5,52
0,132 124.000 5,09
0,236 80.000 4,90
0,360 49.100 4,69
0,409 34.800 4,54
0,456 28.900 4,46
0,558 20.600 4,31
0,779 7.100 3,85
Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa Lg (trọng lượng phân tử) của protein trong thang chuẩn với Rf. Tiến hành xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính
106
tương quan giữa giá trị Rf và Lg của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel, ta được phương trình sau:
y = - 2.1043x + 5.4483
Trong đó: y - Lg trọng lượng phân tử protein; x - Rf tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển của phẩm màu bromophenol blue.
Hình 3.14. Đường chuẩn protein Dựa vào thang chuẩn protein ta có kết quả như sau:
Y= Lg MW => MW = 10Y
Hình 3.15. SDS-PAGE enzyme tôm hùm bông
Giếng 1: Thang protein chuẩn, Giếng 2: Enzyme protease thô trước sắc ký Giếng 3: Enzyme protease sau sắc ký, Giếng 4: Enzyme amylase thô trước sắc ký, Giếng 5: Enzyme amylase sau sắc ký, Giếng 6: Enzyme lipase thô trước sắc
ký, Giếng 7: Enzyme lipase sau sắc ký.
107
Bảng 3.44. Trọng lượng phân tử enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm bông sau sắc ký
Enzyme Rf Trọng lượng phân tử Da
Protease 0,456 30792,47
Amylase 0,439 33463,33
Lipase 0,389 42480,93
Tiến hành chạy điện di SDS-PAGE enzyme có trong tuyến tiêu hóa tôm hùm xanh, kết quả cho thấy sau khi sắc ký lọc gel, protease có trọng lượng phân tử khoảng 30,8 KDa, amylase có trọng lượng phân tử 33,5 KDa, lipase có trọng lượng phân tử 42,5 KDa.
Theo dữ liệu về trọng lượng phân tử cho động vật giáp xác khác như tôm L. vannamei và P. paulensis: trypsin của tôm trong khoảng 17,7-22 kDa, chymotrypsin tôm 24-30 kDa 87. Trọng lượng phân tử chymotrypsin tôm hùm P. interruptus trong khoảng 21-60 kDa, lớn hơn so với trypsin 85. Perera et al trong nghiên cứu về enzyme tiêu hóa tôm hùm P. argus chỉ ra rằng trọng lượng phân tử trypsin trong khoảng 17-21 KDa, chymotrysin là 23-38 KDa, amylase là 38-47 KDa còn esterase không tìm thấy hoạt tính 102. H. Brockerhoff et al trong kết quả nghiên cứu enzyme tuyến tiêu hóa tôm hùm Mỹ H. americanus công bố rằng lipase có trọng lượng phân tử 43 KDa, proteolytic enzyme có trọng lượng trong khoảng 25-50 KDa. Tôm hùm phân bố rất rộng ở vùng biển nhiệt đới trên khắp thế giới và được quyết định bởi tính di truyền vào quá trình thích nghi của loài với các điều kiện tự nhiên, môi trường ở từng vùng biển. Trong quá trình thích nghi để sinh tồn này, có thể ảnh hưởng đến hệ enzyme của tôm hùm, cụ thể hơn là tính chất các enzyme trong hệ tiêu hóa 34.