PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.4 Nội dung 4: Đánh giá mức độ hoàn thiện của quy trình thông qua
2.2.4.2. Nghiên cứu các bệnh thường gặp trên tôm hùm khi sử dụng thức ăn
Vật liệu và phương pháp thu mẫu
Mẫu tôm hùm (7 con) được thu ngẫu nhiên, định kỳ 20 ngày/lần và thu đột xuất nếu tôm có biểu hiện bất thường. Mẫu được vận chuyển sống về Phòng thí nghiệm bệnh học thủy sản, Trường Đại học Nha Trang để phân tích sự hiện diện của các tác nhân vi sinh vật thường gây bệnh trên hai đối tượng này. Thờ i gian thí nghiê ̣m từ 15/1/2014 – 11/5/2014.
Phương pháp nghiên cứu
57
Sơ đồ nghiên cứu bệnh trên tôm hùm nuôi bằng thức ăn của dự án được trình bày trong hình 2.25.
Hình 2.25. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Phương pháp phân tích mẫu
Có 21 con tôm hùm được kiểm tra từ 3 đợt thu mẫu định kỳ (Đợt 1 đối chứng, tôm khỏe) và không có tôm nào được kiểm tra do có những biểu hiện bất thường như: bỏ ăn, màu sắc thay đổi hay bị sinh vật bám v.v... Trong 7 con tôm/đợt kiểm tra, có 2 con được cố định dùng cho việc chạy PCR; 5 con còn lại được kiểm tra sơ bộ, sau đó làm tiêu bản kiểm tra ký sinh trùng ngoại và nội ký sinh, lấy mẫu gan tụy để nuôi cấy vi khuẩn, nuôi cấy nấm (nếu phát hiện có sợi nấm ký sinh) và cuối cùng, dùng toàn bộ phần đầu tôm (gồm gan tụy và mang) cố định trong dung dịch Davidson’s phục vụ cho việc cắt mô (kiểm tra theo phương pháp mô bệnh học). Cụ thể như sau:
Đề xuất các biện pháp phòng trị bệnh Kiểm tra sự hiện diện của
các tác nhân gây bệnh Nghiên cứu các bệnh thường gặp trên tôm hùm khi sử dụng thức ăn
của dự án và các biện pháp phòng trị bệnh Thu mẫu định kỳ và mẫu có biểu hiện bất thường,
vận chuyển về phòng thí nghiệm để kiểm tra
Kiểm tra sơ bộ (Hình dạng, màu sắc bộ phụ,
sinh vật bám v.v…)
Kiểm tra ký sinh
trùng ngoại ký sinh, nội
ký sinh
Kiểm tra
vi khuẩn
Kiểm tra nấm
Kiểm tra virút
58
Kiểm tra sơ bộ
Mẫu tôm được kiểm tra sơ bộ bằng mắt thường và bằng kính lúp. Kiểm tra màu sắc, hình dạng và các bộ phụ của tôm. Dùng kính lúp kiểm tra sự hiện diện của nấm, ký sinh trùng ngoại ký sinh và các sinh vật bám v.v... Sau đó, dùng xi lanh 1mL lấy mẫu máu từ gốc chân bò thứ 5 của tôm để kiểm tra ký sinh trùng nội ký sinh và soi tươi kiểm tra vi khuẩn.
Kiểm tra sự hiện diện của các tác nhân gây bệnh thường gặp:
+ Kiểm tra ký sinh trùng: Sau khi tôm được quan sát bên ngoài, chúng tiếp tục được kiểm tra ký sinh trùng theo phương pháp của Dogiel (1960), được Hà Ký (1968) sửa đổi, bổ sung. Tuần tự các cơ quan tôm được giải phẩu và kiểm tra ký sinh trùng như mang, gan tụy, ruột và cơ, những nơi thường bắt gặp ký sinh trùng 16.
+ Kiểm tra vi khuẩn: soi tươi, kiểm tra vi khuẩn từ máu tôm, gan tuỵ.
Sau đó, lấy mẫu bệnh phẩm và tiến hành nuôi cấy, phân lập vi khuẩn theo phương pháp của Evans (2003) và Whitman (2004) 56, 123. Kiểm tra nấm:
mẫu tôm được đưa về kiểm tra sơ bộ, nếu quan sát thấy có sự xuất hiện của các sợi nấm, tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm và sử du ̣ng các môi trường nuôi cấy nấm thông thường như: SDA (Sabouraud dextrose agar) hoặc PDA (Potato dextrose agar) + 2% NaCl + Streptomycine và Ampicilline để phát hiện nấm gây bệnh trên tôm; thời gian nuôi cấy ở 30oC trong 72 giờ). Ngoài ra, sự xuất hiện của nấm còn được kiểm tra thông qua phương pháp mô bệnh học.
+ Kiểm tra virút: Kỹ thuật mô bệnh ho ̣c: sử dụng phương pháp mô bệnh học dùng cho giáp xác của Lightner (1996) theo Hình 2.26 88.
59
Hình 2.26. Sơ đồ tiến hành làm tiêu bản mô ho ̣c mẫu tôm hùm
+ Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): tôm hùm được kiểm tra định kỳ (20 ngày/ lần) hoặc đột xuất nếu có biểu hiện bất thường xảy ra về sự
có mặt củ a WSSV (White Spot Syndrome Virus). Tôm được vận chuyển sống về Phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản, Đại học Nha Trang. Sau đó, tôm được cố định với cồn 95% và chạy PCR theo tiêu chuẩn ngành thủ y sản 28 TCN 202:
2004 tại Chi cục Nuôi trồng thủy sản tỉnh Khánh Hòa.
Đề xuất các biện pháp phòng trị bệnh: Từ các kết quả kiểm tra mẫu, dựa trên các tài liệu nghiên cứu đã được công bố, đề xuất các biện pháp phòng trị bệnh.