1.1. ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.1.2. Phương pháp phân tích đồng phân đối quang
1.1.2.2. Phân loại tác nhân chọn lọc hoạt quang
Tác nhân chọn lọc hoạt quang đóng vai trò quan trọng trong phân tích ĐPĐQ, dựa trên phản ứng và ái lực khác nhau giữa tác nhân chọn lọc hoạt quang và các đồng phân tả tuyền, hữu tuyền mà các phức hợp phi đối quang với các đặc điểm hóa lý, năng lượng liên kết và độ bền vững khác nhau được hình thành, trên cơ sở đó các ĐPĐQ trong hỗn hợp được phân tách khỏi nhau. Chính vì vậy, trong quá trình phát triển phương pháp phân tích ĐPĐQ, người ta luôn chú ý nghiên cứu, tìm kiếm tác nhân chọn lọc hoạt quang phù hợp. Trên thực tế, tác nhân chọn lọc hoạt quang khá phổ biến, đa dạng về nguồn gốc và cấu trúc hóa học. Tuy vậy chỉ có một số ít các chất chọn lọc hoạt quang có ái lực khác nhau với các ĐPĐQ của một hỗn hợp racemic [24], [77], [78], [109].
Dựa trên nguồn gốc, bản chất hóa học và cơ chế tạo phức, các tác giả Alain Berthod [24], Gerhard K.E. Scriba và cộng sự [78] đã chia tác nhân chọn lọc hoạt quang thành năm nhóm chính:
Nhóm 1: Một số protein như albumin huyết thanh người (HSA), albumin huyết thanh bò (BSA); α1- acid glycoprotein (AGP); ovalbumin trong trứng gà…; một số cyclopeptid và một số kháng sinh nhóm macrocyclic glycopeptid (vancomycin, teicoplanin, avoparcin, tubocuracin…). Các chất thuộc nhóm 1, có bản chất là các chất hoạt quang tự nhiên, phân tử có nhiều trung tâm bất đối xứng có thể tạo phức hợp với ĐPĐQ theo nhiều cơ chế khác nhau [48], [78], [79]. Ví dụ, cấu tạo và các vị trí hình thành liên kết với các thuốc/ ĐPĐQ của phân tử HSA được trình bày ở Hình 1.4 [78].
Hình 1.4. Cấu tạo, vị trí hình thành liên kết giữa HSA và các ĐPĐQ Chú thích hình: HSA: dải ruy băng, các phối tử (thuốc hoặc ĐPĐQ): quả cầu tô màu.
Nhóm 2: Các oligosaccharid không vòng và các dẫn chất polysaccharid (chủ yếu là các dẫn chất của cellulose và amylose) như các dẫn chất ester, benzoat, carbamat của amylose hay cellulose... Các chất thuộc nhóm này đều là các chất hoạt quang tự nhiên, tạo phức hợp với ĐPĐQ thông qua liên kết hydro, liên kết π-π hay tương tác lưỡng cực... [109], [139], [202]. Cấu tạo một số pha tĩnh HPLC gắn chất chọn lọc hoạt quang dẫn chất của cellulose và amylose được trình bày ở Hình 1.5 [109].
Hình 1.5. Cấu tạo pha tĩnh đối quang dẫn chất polysaccharid cuả một số cột HPLC.
- 13 -
Ngoài các liên kết, tương tác nêu trên các chất chọn lọc hoạt quang thuộc nhóm hai còn có thể tạo phức với ĐPĐQ thông qua cấu trúc thứ cấp “xoáy ốc” của phân tử chất chọn lọc hoạt quang.
Nhóm 3: Các chất chọn lọc hoạt quang phân tử lượng nhỏ, tạo phức hợp với ĐPĐQ dựa trên tương tác 3 điểm trong đó có ít nhất một tương tác giữa tác nhân chọn lọc hoạt quang và ĐPĐQ là liên kết π-π giữa một nhóm cho điện tử π và một nhóm nhận điện tử π (chất chọn lọc hoạt quang kiểu Pirkle). Cấu trúc chung của các chất chọn lọc hoạt quang nhóm này thường có: một nhóm chức acid hoặc base liên kết với vòng thơm (có khả năng hình thành các liên kết π); một nhóm chức/cấu trúc phân cực mạnh có khả năng hình thành liên kết hydro và một nhóm chức/cấu trúc không phân cực tương tác với phân tử ĐPĐQ bằng các lực liên kết Van der Wall. Nhóm chức/cấu trúc không phân cực thường có cấu tạo “cồng kềnh” quyết định hình dạng cấu trúc phân tử chất chọn lọc hoạt quang và ít nhất một trong 3 nhóm chức/cấu trúc nêu trên của tác nhân chọn lọc hoạt quang sẽ phân bố ở gần vị trí nguyên tử carbon bất đối của phân tử.
Các chất chọn lọc hoạt quang nhóm này rất đa dạng, có cả các chất có nguồn gốc tự nhiên và các chất bán tổng hợp hóa học như dẫn chất 3,5-dinitrobenzoyl của 1,2- diaminocyclohexan; 3,5-dinitrobenzoyl leucin; 3,5-dinitrobenzoyl phenylglycin... hay các dẫn chất của quinin, quinidin như tert-butylcarbamoylquinin... Hiện có tới gần 100 loại cột sắc ký lỏng mà thành phần pha tĩnh là silicagen liên kết với chất chọn lọc hoạt quang thuộc nhóm này. Cấu tạo một số pha tĩnh của cột sắc ký lỏng chứa tác nhân chọn lọc hoạt quang nhóm 3 được trình bày ở Hình 1.6 [164], [187].
Hình 1.6. Cấu tạo một số pha tĩnh liên kết tác nhân hoạt quang kiểu Pirkle
Nhóm 4: Các chất chọn lọc hoạt quang mà cấu trúc phân tử có các “hốc” chọn lọc đối quang tạo “phức lồng” với đồng phân, bao gồm các cyclodextrin (CD) và dẫn chất, các ether vòng và một số polymer... Trong nhóm này, CD và dẫn chất là tác nhân chọn lọc hoạt quang tự nhiên, còn ether vòng và các polymer thường là tác nhân chọn lọc hoạt quang tổng hợp hoặc bán tổng hợp hóa học.
Cyclodextrin và dẫn chất: Cyclodextrin (CD) là các oligosaccharid mạch vòng do các đơn vị D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết α(1-4) tạo thành. Các CD khác nhau ở số đơn vị glucose và số lượng các nhóm hydroxyl. Các CD có cấu trúc hình nón cụt rỗng với một “hốc” có bề mặt phía trong kỵ nước và phía ngoài thân nước.
Vành hẹp của hốc được tạo thành từ các nhóm 6-OH sơ cấp, vành rộng hơn được tạo thành từ các nhóm 2- và 3-OH thứ cấp. Các liên kết -O- của dị vòng quay vào trong tạo hốc rỗng kỵ nước. Cấu tạo chung của các CD được trình bày ở Hình 1.7, các đặc điểm hóa lý của một số CD tự nhiên được trình bày ở Bảng 1.2 [53], [181], [196].
Bảng 1.2. Tính chất hóa lý của một số cyclodextrin tự nhiên
Tính chất Loại cyclodextrin
α β γ
Số đơn vị glucose 6 7 8
Số nhóm hydroxyl 18 21 24
Trọng lượng phân tử (MW) 972 1135 1297
Đường kính trong của “hốc” (nm) 0,47-0,52 0,60-0,64 0,75-0,85 Đường kính ngoài của “hốc” (nm) 1,46 ± 0,05 1,54 ± 0,04 1,75 ± 0,04
Thể tích “hốc” (nm3) 0,176 0,346 0,510
Độ tan trong nước ở 250C (g/100ml) 14,50 1,85 23,20
Hình 1.7. Cấu tạo và kích thước hốc kỵ nước của các cyclodextrin.
- 15 -
Khi thay đổi hóa học ở các nhóm -OH tự do của CD bằng cách cho phản ứng tạo liên kết với các nhóm thế khác nhau, người ta thu được các dẫn chất CD có mức độ phân cực, độ tan, khả năng liên kết tạo phức… khác nhau [53], [181], [196]. Cấu trúc của một số dẫn chất CD được trình bày ở Hình 1.8 [196].
Hình 1.8. Cấu trúc của một số tác nhân hoạt quang dẫn chất cyclodextrin Sự hình thành “phức lồng” giữa ĐPĐQ (chất lạ) và tác nhân chọn lọc hoạt quang dẫn chất CD liên quan đến quá trình “lồng” các gốc thân dầu của phân tử chất lạ vào
“hốc rỗng” của các CD thay thế cho phân tử dung môi (thông thường là nước) ở phía trong của hốc rỗng [152], [196]. Các phân tử lạ ăn khớp toàn bộ phân tử hoặc phần kỵ nước với hốc rỗng của phân tử CD. Tương tác kỵ nước với riêng hốc rỗng là không đủ để có thể tách các chất ĐPĐQ, các liên kết yếu giữa các nhóm thế ở trung tâm bất đối trong cấu trúc chất phân tích và các nhóm hydroxyl thứ cấp và/hoặc sơ cấp của CD chịu trách nhiệm chính cho cơ chế nhận diện chọn lọc đối quang. Tùy vào chất tan, loại CD và môi trường thực nghiệm mà quá trình lồng phân tử chất tan vào phân tử CD có thể xảy ra ở vành sơ cấp hoặc vành thứ cấp [53], [152]. Các dẫn chất CD có các nhóm -OH tự do liên kết với các nhóm thế khác nhau nên mức độ phân cực và khả năng tạo phức với ĐPĐQ của các dẫn chất CD khác so với các CD tự nhiên. Tùy thuộc vào số lượng các nhóm –OH tự do, số lượng và cấu trúc của các nhóm thế mà các dẫn chất CD sẽ có độ phân cực, độ tan, khả năng và cơ chế tạo phức khác nhau. Ngoài tương tác kỵ nước và hình thành “phức lồng” với các ĐPĐQ, các dẫn chất CD có thể có thêm tương tác ion trong trường hợp nhóm thế tích điện hoặc tương tác π-π khi các nhóm thế có chứa nhân thơm [53], [152].
Các ether dạng vòng [30], [142], [196]: Các ether dạng vòng là các polyether macrocyclic có khả năng tạo phức chất với các cation vô cơ và hữu cơ. Sự thay đổi ở vòng ether với việc có thêm bốn nhóm carboxylic làm cho nhóm này có thể sử dụng làm chất chọn lọc đối quang. Phức hợp giữa ether dạng vòng và các ĐPQH có nhóm chức amin được tạo thành nhờ các liên kết hydro giữa nhóm chức với các nguyên tử
oxy của vòng macrolid. Cấu trúc một số ether dạng vòng thường được sử dụng làm chất chọn lọc đối quang trong phương pháp điện di mao quản phân tích các ĐPĐQ được trình bày ở Hình 1.9 [196].
Hình 1.9. Một số chất chọn lọc đối quang có cấu trúc vòng ether thường dùng trong phương pháp CE phân tích ĐPĐQ.
Nhóm 5: Tác nhân chọn lọc hoạt quang đồng tạo phức kiểu chelat với ĐPĐQ theo cơ chế trao đổi phối tử thông qua một nguyên tố kim loại. Các tác nhân chọn lọc hoạt quang nhóm này được phát triển độc lập bởi Davankov và Bernauer vào những năm 1960 [78], [109], [164], [187]. Một số kim loại như đồng (II), niken (II), rutheni (II)…
có khả năng tạo phức kiểu chelat đa hóa trị với tác nhân chọn lọc đối quang. Trong dung dịch phức hợp này có sự trao đổi phối tử, thay một phân tử chất chọn lọc hoạt quang bằng ĐPĐQ để tạo phức hợp chứa đồng thời cả chất chọn lọc và ĐPĐQ. Phản ứng tạo phức chelat kép của đồng (II) và các ĐPĐQ, chất chọn lọc hoạt quang được biểu diễn theo sơ đồ:
Cu(L-Sel)2+ S-A Cu(L-Sel)(S-A) + L-Sel Cu(L-Sel)2+ R-A Cu(L-Sel)(R-A) + L-Sel Trong đó: + Sel: Tác nhân chọn lọc hoạt quang;
+ R-A, S-A: Đồng phân tả tuyền, hữu tuyền của hoạt chất cần phân tích.
Ví dụ cấu trúc phức hợp chelat phi đối quang, hình thành giữa chất chọn lọc hoạt quang N-(2-hydroxypropyl)-L-4-hydroxyprolin và các đồng phân tả tuyền, hữu tuyền của một acid amin theo cơ chế trao đổi phối tử được trình bày ở Hình 1.10 [109].
- 17 -
Hình 1.10. Cấu trúc phức hợp N-(2-hydroxypropyl)-L-4-hydroxyprolin và các đồng phân đối quang của acid amin.
Để phân tách các ĐPĐQ theo cơ chế trao đổi phối tử, tác nhân chọn lọc hoạt quang và ĐPĐQ phải có cấu trúc phù hợp, phân tử phải chứa ít nhất hai nhóm chức hoặc hai nguyên tố dị tố (như N, S hoặc O…) ở gần trung tâm bất đối của phân tử và các nhóm chức/dị tố phải có khả năng cho nguyên tố kim loại các điện tử để hình thành phức hợp chelat. Các tác nhân chọn lọc hoạt quang thuộc nhóm này thường là các acid amin như prolin, hydroxyprolin, cystein, phenylalanin, penicillamin, leucin…
và dẫn chất, chúng có khả năng tách tốt hỗn hợp racemic của các amino acid, amino alcol và hydroxyl acid [78], [109], [164].