CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. PHÂN TÍCH ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN TRONG CHẾ PHẨM
3.1.1. Nghiên cứu phương pháp CE phân tích đồng phân đối quang atenolol
3.1.1.1. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện điện di
Điện di dung dịch chuẩn R,S-ATN nồng độ 100 ppm trên cột mao quản silica nung chảy cú kớch thước 48,5 cm ì 50 àm i.d (chiều dài hiệu dụng 40 cm) cựng cỏc điều kiện điện di ban đầu như sau: điện thế mao quản 24 kV, tiêm mẫu 50 mbar × 3 s, bước sóng phát hiện λ = 194 nm và các dung dịch điện ly nền gồm 50 mM chất chọn lọc đối quang β-CD lần lượt hòa tan trong các dung dịch đệm: (a) đệm borat 50 mM, pH 9; (b) tetrabutylamoni sulfat 50 mM, điều chỉnh pH 2 bằng acid sulfuric và (c) Tris(hydroxymethyl)aminomethan 50 mM điều chỉnh pH 4 bằng acid phosphoric.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của bản chất dung dịch đệm đến thời gian di chuyển của ATN được trình bày ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của các dung dịch đệm borat (a), tetrabutylamoni sulfat 50 mM (b) và Tris(hydroxymethyl)aminomethan 50 mM (c) tới t của atenolol
(a)
(b)
(c)
Kết quả nghiên cứu cho thấy: Hệ đệm borat có pH cao, dòng EOF lớn làm cho thời gian di chuyển (tM) của ATN kéo dài, tín hiệu đo (diện tích, chiều cao pic) giảm.
Hệ đệm tetrabutylamoni sulfat, do pH thấp nên tác động của dòng EOF là tối thiểu, tM của ATN ngắn. Tuy vậy, pH thấp làm giảm khả năng tạo “phức lồng” giữa các ĐPĐQ của ATN với tác nhân hoạt quang do đó làm giảm khả năng tách các ĐPĐQ của phương pháp. Hệ đệm phosphat - Tris(hydroxymethyl)aminomethan 50 mM, pH 4 có khả năng đệm tốt, dòng EOF không lớn, cường độ dòng điện thấp, tM của ATN không quá dài và có khoảng pH phù hợp cho việc tạo phức lồng giữa các ĐPĐQ với β-CD.
Do vậy, hệ đệm này được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
b. Lựa chọn tác nhân chọn lọc đối quang
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn R,S-ATN với dung dịch đệm TRIS 50 mM, pH 4 chứa một trong ba tác nhân đối quang sau: (a) CD tự nhiên: β-CD; (b) dẫn chất β-CD không mang điện: Hydroxylpropyl β-CD (HP-β-CD) và (c) dẫn chất β-CD mang điện tích: Carboxymethyl β-CD (CM-β-CD). Các điều kiện điện di khác như cột mao quản, điện thế mao quản, chế độ tiêm mẫu… giống nhau giữa các lần phân tích.
Điện di đồ phân tích mẫu chuẩn R,S-ATN với dung dịch điện ly nền chứa các tác nhân đối quang khác nhau được trình bày ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Điện di đồ phân tích atenolol với ba tác nhân chọn lọc đối quang:
a) β-CD 20 mM; b) HP-β-CD 25 mM, c) CM-β-CD 8 mM (a)
(b)
(c)
Kết quả thực nghiệm, các pic R-ATN và S-ATN phân tách khi dung dịch điện ly nền chứa CM-β-CD (Hình 3.2c). Do vậy, tác nhân chọn lọc đối quang CM-β-CD được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
c. Khảo sát và lựa chọn pH dung dịch đệm
Sự thay đổi pH dung dịch đệm ảnh hưởng đến EOF, độ phân giải và thời gian di chuyển của các chất phân tích. Linh độ và điện tích của chất phân tích và tác nhân chọn lọc đối quang phụ thuộc trực tiếp vào pH dung dịch đệm. Do vậy, cần thiết phải nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch đệm tới độ phân giải giữa ĐPĐQ của ATN khi phân tích bằng phương pháp CE với CM-β-CD là tác nhân chọn lọc đối quang .
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH trong khoảng từ 2,5 đến 7,5 ( pH = 0,5) tới độ phân giải của các pic R-ATN và S-ATN được trình bày trong Hình 3.3.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến độ phân giải của atenolol Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi pH dung dịch đệm thay đổi trong khoảng 2,5 đến 6,0 độ phân giải giữa các pic đồng phân ATN có sự thay đổi nhưng vẫn đáp ứng yêu cầu (Rs ≥ 2). Ở pH 4,0 độ phân giải đạt giá trị cao nhất (Rs 3). Do đó, pH của dung dịch đệm là 4,0 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
d. Kết quả khảo sát xây dựng phương pháp CE phân tích các ĐPĐQ của ATN
Cố định cột mao quản; chế độ tiêm mẫu; bước sóng phát hiện; nồng độ, pH dung dịch đệm; tác nhân chọn lọc đối quang, lần lượt thay đổi: chiều dài hiệu dụng cột mao quản (40 – 60 cm); hiệu điện hai đầu mao quản (từ 12 kV đến 30kV); nồng độ CM-β-CD trong dung dịch điện ly nền (từ 6 mM đến 10 mM), chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện thích hợp nhất để phân tích các ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm bằng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) trên thiết bị Agilent G1600AX như sau:
- Cột mao quản silica nung chảy kớch thước 48,5 cm ì 50 àm (chiều dài hiệu dụng 40 cm). Nhiệt độ mao quản: 25 C. Điện thế hai đầu mao quản 25 kV;
- Dung dịch điện ly nền: Đệm TRIS 50mM pH 4,0 chứa 8mM CM-β-CD;
- Chế độ tiêm mẫu: 50 mbar × 3 s;
- Đầu dò: PDA, λ = 194 nm.
Hình 3.4 là điện di đồ mẫu chuẩn R,S-ATN 100 ppm phân tích bằng phương pháp CZE với các điều kiện điện di như trên. Trên điện di đồ, các pic R-ATN và S-ATN tách nhau hoàn toàn với thời gian phân tích dưới 12 phút. Điện di đồ xây dựng phương pháp CE phân tích các ĐPĐQ của ATN được trình bày ở phụ lục 4.1 của luận án.
Hình 3.4. Điện di đồ mẫu chuẩn R,S-Atenolol nồng độ 100 ppb 3.1.1.2. Thẩm định phương pháp CE phân tích ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm a. Độ phù hợp hệ thống điện di
Tiến hành điện di lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn R,S-ATN 100 ppm trong cùng điều kiện. Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống CE được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ phù hợp của hệ thống điện di Số
TT
S-Atenolol R-Atenolol
Rs
tm (phút)
Diện tích pic (mAU.s)
Hệ số đối xứng
tm (phút)
Diện tích pic (mAU.s)
Hệ số đối xứng
1 9,389 272,1 1,2 9,915 276,1 1,3 2,7
2 9,374 264,1 1,3 10,036 274,3 1,2 2,7
3 9,262 262,8 1,2 9,908 265,2 1,4 3,2
4 9,408 263,7 1,3 10,081 268,3 1,4 3,0
5 9,279 267,3 1,4 9,852 270,3 1,4 2,5 6 9,215 266,2 1,3 9,755 269,5 1,4 2,4 Trung bình 9,321 266,0 1,3 9,924 270,6 1,4 2,7
RSD (%) 0,9 1,3 5,9 1,2 1,5 6,2 -
Giá trị RSD đối với thời gian di chuyển và diện tích pic của hai đồng phân S-ATN và R-ATN đều nằm trong giới hạn cho phép (nhỏ hơn 2%), độ phân giải giữa hai đồng phân > 2, chứng tỏ hệ thống CE phù hợp để định lượng các ĐPĐQ của ATN.
b. Độ đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp CE
Tiến hành điện di lần lượt các dung dịch giả dược, dung dịch chuẩn ATN racemic, dung dịch thử ATN racemic chuẩn bị từ viên nén Atenolol STADA 50 mg và dung dịch chuẩn S-ATN trong cùng một điều kiện.
Điện di đồ mẫu giả dược và các mẫu chuẩn, mẫu thử ATN được trình bày ở Hình 3.5. Phổ UV và phổ tinh khiết của các pic ATN trên ĐDĐ được trình bày ở Hình 3.6.
2 4 6 8 10 12 min
mAU
0 50 100 150 200
DAD1 D, Sig=194,4 Ref=360,100 (ATENOLOL\130518000586.D)
min
2 4 6 8 10
mAU
0 50 100 150 200
DAD1 D, Sig=194,4 Ref=360,100 (ATENOLOL\130518000569.D)
A 9.279rea: 266.53 A 9.834rea: 272.385
min
2 4 6 8
mAU
0 50 100 150 200 250
DAD1 D, Sig=194,4 Ref=360,100 (ATENOLOL\130518000588.D)
9.300
min
2 4 6 8 10
mAU
0 50 100 150 200
DAD1 D, Sig=194,4 Ref=360,100 (ATENOLOL\130518000608.D)
Area: 267 .433
9.349
Area: 273 .129
9.963
Hình 3.5. Điện di đồ các mẫu placebo (a), chuẩn R,S-Atenolol (b), chuẩn S-Atenolol (c) và mẫu thử Atenolol STADA (d)
Hình 3.6. Phổ UV (a) và phổ tinh khiết (b) của các pic ATN trên ĐDĐ mẫu thử
(a) (b)
(c) (d)
(a) (b)
Trên ĐDĐ của mẫu giả dược (Hình 3.5a) không xuất hiện pic ở thời điểm xuất hiện pic ở các mẫu chuẩn (Hình 3.5b, c) và mẫu thử (Hình 3.5d). Thời gian di chuyển của các pic trên ĐDĐ mẫu thử tương ứng với thời gian di chuyển của các pic trên ĐDĐ mẫu chuẩn. Thời gian di chuyển của đồng phân S-ATN là khoảng 9,3 phút (Hình 3.5c) tương ứng với đồng phân di chuyển trước trên ĐDĐ mẫu chuẩn racemic và mẫu thử. Phổ UV của các pic ATN trên ĐDĐ mẫu thử và mẫu chuẩn tương tự nhau (Hình 3.6a). Các pic ATN trên ĐDĐ có độ tinh khiết > 0,99 (Hình 3.6b). Như vậy, phương pháp CE có độ đặc hiệu đáp ứng quy định.
c. Khoảng nồng độ tuyến tính
Tiến hành điện di dãy dung dịch chuẩn R,S-ATN có nồng độ từ 40 đến 140 ppm, bằng phương pháp CE đã xây dựng. Các dung dịch chuẩn ATN được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc ATN có nồng độ chính xác khoảng 1000 ppm với dung dịch đệm TRIS 50 mM theo các hệ số pha loãng khác nhau.
Phân tích hồi quy mối tương quan và hệ số tương quan (r) giữa diện tích pic (y) và nồng độ dược chất có trong mẫu (x) bằng phương pháp bình phương tối thiểu.
Kết quả xác định mối tương quan được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Mối tương quan giữa nồng độ ATN và diện tích pic trên điện di đồ
Nồng độ R,S-Atenolol (ppm) 40,184 60,276 80,368 100,460 120,552 140,644 Tổng diện tích pic (mAU.s) 214,1 322,6 423,4 540,2 642,2 750,0
Phương trình hồi quy tuyến tính y = 5,340x - 0,715; r = 0,9999
Nồng độ S-Atenolol (ppm) 20,040 30,060 40,080 50,100 60,120 70,139 Diện tích pic (mAU.s) 106,4 160,4 209,3 266,6 318,7 371,3
Phương trình hồi quy tuyến tính y = 5,294x + 0,065; r = 0,9999
Nồng độ R-Atenolol (ppm) 20,044 30,066 40,088 50,110 60,132 70,153 Diện tích pic (mAU.s) 107,7 162,2 214,1 273,6 323,5 378,7
Phương trình hồi quy tuyến tính y = 5,412x - 0,780; r = 0,9998
Kết quả thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ từ 20 – 70 ppm đối với các đồng phân R-ATN, S-ATN và từ 40 – 140 ppm đối với ATN racemic có mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa giá trị diện tích pic với nồng độ tương ứng của mỗi chất trong mẫu. Các đường hồi quy có dạng đường thẳng với hệ số tương quan r > 0,999.
d. Độ lặp lại và tái lặp của phương pháp
Tiến hành phân tích nhiều lần, xác định hàm lượng R-ATN, S-ATN và R,S-ATN trong mẫu chế phẩm thử chứa ATN racemic bằng phương pháp CE đã xây dựng.
Mẫu thử được chuẩn bị bằng cách hòa tan lượng bột viên tương ứng với khoảng 25 mg ATN trong vừa đủ 25 ml đệm TRIS 50 mM, pH 4. Lọc qua màng lọc 0,45àm, thu dịch lọc. Pha loãng dịch lọc 10 lần với cùng dung dịch đệm.
Kết quả xác định độ lặp lại và tái lặp của phương pháp được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Độ lặp lại và tái lặp của phương pháp CE.
Số TT
Khối lượng cân
(g)
S-Atenolol R-Atenolol Tổng hàm
lượng (mg/viên) S. pic
(mAU.s)
Hàm lượng (mg/viên)
S. pic (mAU.s)
Hàm lượng (mg/viên) Kết quả phân tích ngày thứ 1
1 0,0775 270,4 24,1 274,4 25,2 49,2
2 0,0742 265,6 24,7 273,0 26,1 50,9
3 0,0760 269,1 24,5 274,9 25,7 50,2
4 0,0754 268,1 24,6 272,2 25,6 50,2
5 0,0781 270,1 23,9 276,6 25,2 49,0
6 0,0747 266,5 24,6 273,2 26,0 50,6
Trung bình (n = 6) 24,4 - 25,6 50,0
RSD (%) 1,4 - 1,6 1,5
Kết quả phân tích ngày thứ 2
7 0,0751 266,5 24,4 272,0 25,6 50,0
8 0,0739 265,5 24,8 270,4 25,9 50,6
9 0,0745 265,7 24,6 272,5 25,8 50,4
10 0,0752 261,3 23,9 262,1 24,6 48,6
11 0,0726 258,7 24,5 260,2 25,3 49,9
12 0,0733 255,4 24,0 264,7 25,5 49,5
Trung bình (n = 6) 24,4 - 25,5 49,8
RSD (%) 1,4 - 1,8 1,5
Tổng hợp kết quả phân tích hai ngày
Trung bình (n = 12) 24,4 - 25,5 49,9
RSD (%) 1,3 - 1,7 1,4
Kết quả phân tích cho thấy, phương pháp có độ chính xác đạt yêu cầu, giá trị RSD% của các kết quả phân tích trong ngày và giữa hai ngày đều nhỏ hơn 2,0%.
e. Độ đúng
Tiến hành thẩm định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn, thêm chính xác một lượng chuẩn R,S-ATN vào mẫu giả dược. Lượng chất chuẩn thêm vào tương đương 80%, 100%, 120% nồng độ định lượng. Mẫu thẩm định độ đúng được chuẩn bị bằng cách hòa tan một lượng cân chính xác khoảng 40 – 60 mg chuẩn R,S-ATN cùng với khoảng 100 mg tá dược trong vừa đủ 50 ml đệm TRIS 50 mM, pH 4. Lọc qua màng lọc 0,45àm, thu dịch lọc. Pha loóng dịch lọc 10 lần với cựng dung dịch đệm.
Kết quả xác định độ đúng của phương pháp trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả xác định độ đúng của phương pháp CE Số
TT
Khối lượng cân (mg)
Lượng chuẩn thêm vào mẫu (mg)
Diện tích pic (mAu.s)
Lượng hoạt chất
thu hồi (mg)* Độ đúng (%) Tá
dược R,S- ATN
S- ATN
R- ATN
S- ATN
R- ATN
S- ATN
R- ATN
S- ATN
R- ATN 1 97,6 39,9 19,910 19,914 210,3 213,3 19,706 19,691 99,0 98,9 2 102,6 40,3 20,110 20,114 214,0 218,2 20,053 20,142 99,7 100,1 3 100,8 40,2 20,060 20,064 213,5 216,0 20,006 19,939 99,7 99,4 4 98,4 49,8 24,850 24,855 261,9 270,0 24,543 24,908 98,8 100,2 5 99,6 50,4 25,150 25,155 264,6 275,5 24,796 25,414 98,6 101,0 6 101,2 50,2 25,050 25,055 264,4 270,5 24,778 24,954 98,9 99,6 7 104,8 59,8 29,840 29,846 312,8 322,6 29,315 29,748 98,2 99,7 8 103,6 60,5 30,190 30,196 317,8 325,1 29,783 29,978 98,7 99,3 9 103,0 60,3 30,090 30,096 316,6 320,1 29,671 29,518 98,6 98,1
Trung bình 98,9 99,5
SD 0,51 0,84
RSD (%) 0,5 0,9
(*): Lượng thu hồi xác định bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện.
Kết quả trình bày ở Bảng 3.4 cho thấy, phương pháp có độ đúng cao từ 98,1% đến 101,0% (trung bình 98,9% đối với S-ATN và 99,5% đối với R-ATN) đáp ứng yêu cầu.
Các kết quả thẩm định độ đặc hiệu-chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, chụm ở các mục trên cho thấy, phương pháp CE đã nghiên cứu phù hợp để định lượng ATN và các ĐPĐQ trong chế phẩm thuốc. Tuy nhiên, do nhiễu đường nền lớn, diện tích các pic ATN trên ĐDĐ không cao nên giá trị LOQ của phương pháp khá lớn, không phù hợp để xác định hàm lượng tạp R-ATN trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm S-ATN.