Về phương pháp xử lý mẫu huyết tương, chiết atenolol và các đồng phân
Nguồn ion hóa ESI của thiết bị LC-MS/MS, với cơ chế nhiễm điện bề mặt thích hợp để ion hóa ATN. Quá trình ion hóa ATN ở nguồn ESI bị ảnh hưởng bởi các chất đồng rửa giải trong dòng pha động sắc ký. Do vậy, phương pháp xử lý mẫu huyết tương loại bỏ tạp chất, loại bỏ các tác nhân ảnh hưởng đến quá trình ion hóa ATN ở nguồn ESI và thu hồi chất cần phân tích với tỷ lệ cao, lặp lại có vai trò quan trọng khi phân tích các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương bằng LC-MS/MS.
So với kỹ thuật SPE của Sridharan D. và cộng sự [173], kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương nghiên cứu trong luận án (chiết lỏng – lỏng bằng dung môi hữu cơ) vẫn có độ thu hồi ATN cao (xấp xỉ 90%) và không gây ảnh hưởng nền mẫu nhưng lại đơn giản hơn; không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt; dễ dàng triển khai tại nhiều phòng thí nghiệm, mang lại hiệu quả kinh tế cao khi áp dụng trong các nghiên cứu phải phân tích một số lượng lớn các mẫu huyết tương như các nghiên cứu SKD và đánh giá TĐSH.
Kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương bằng kết tủa protein của Mohamed S. [134] đơn giản, độ thu hồi ATN khá cao (60 – 70%) song không loại bỏ được các tác nhân gây ảnh hưởng nền mẫu làm giảm tỷ lệ ion hóa ATN ở nguồn ESI. Phương pháp xử lý mẫu HT nghiên cứu trong luận án có độ thu hồi hoạt chất cao hơn, nền mẫu sạch hơn không gây ảnh hưởng nền mẫu khi phân tích bằng LC-MS/MS.
ATN là một base yếu (pKa = 9,6), độ tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực tăng khi pH dung dịch mẫu tăng [131]. Do vậy, áp dụng kỹ thuật kiềm hóa mẫu
huyết tương bằng dung dịch amoniac 0,1M trước khi tiến hành chiết lỏng – lỏng với chloroform đã làm tăng độ thu hồi hoạt chất của quy trình xử lý mẫu. Kết quả thực nghiệm cho thấy, quy trình xử lý mẫu huyết tương nghiên cứu trong luận án cho độ thu hồi ATN cao (xấp xỉ 90%) tương đương với quy trình xử lý mẫu của các tác giả Abreu LR. và cộng sự [21] hay Yilmaz B. và cộng sự [204].
Về phương pháp phân tích phổ khối lượng MS/MS của atenolol
- Tối ưu hóa các điều kiện ion hóa tại nguồn ESI: Trong cấu tạo của các thiết bị sắc ký lỏng – khối phổ, nguồn ion hóa không chỉ có nhiệm vụ ion hóa phân tử dược chất cần phân tích tạo các ion ban đầu mà còn có nhiệm vụ kết nối giữa thiết bị nạp mẫu (HPLC) và thiết bị phát hiện – phân tích phổ khối (MS). Thiết bị MS chỉ có khả năng phân tích khối các tiểu phân mang điện ở pha khí trong một môi trường có áp suất giảm (10-5–10-6 Torr.) trong khi đó dòng dung môi pha động chứa chất cần phân tích đi ra khỏi thiết bị HPLC lại ở thể lỏng. Do vậy, việc nghiên cứu các điều kiện ion hóa hoạt chất cần phân tích tại nguồn ion hóa cũng như bay hơi dòng dung môi pha động, chuyển chất cần phân tích sang pha khí khi đi vào thiết bị MS giữ vai trò quan trọng và quyết định đến độ nhạy, độ đúng, độ chính xác của phương pháp MS.
- Nội chuẩn của phương pháp phân tích LC-MS/MS: Phần lớn các phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học đều không trực tiếp xác định được chất cần phân tích trong mẫu mà chỉ có thể xác định được hoạt chất sau khi đã xử lý mẫu, chiết tách hoạt chất khỏi mẫu dịch sinh học. Quá trình chiết tách hoạt chất khỏi nền mẫu gồm nhiều giai đoạn và độ thu hồi hoạt chất phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Do vậy, các phương pháp phân tích thuốc trong dịch học thường sử dụng các chất nội chuẩn để giảm thiểu sai số trong quá trình phân tích. Với phương pháp phân tích bằng phổ khối, nội chuẩn thích hợp nhất chính là dược chất đồng vị phóng xạ (có cùng công thức phân tử, song trong công thức cấu tạo một hoặc một số nguyên tử 1H được thay thế bằng các nguyên tử đồng vị phóng xạ 2D) khi đó, dược chất và nội chuẩn có các tính chất hóa lý giống nhau nhưng khác nhau về số khối. Tuy vậy, tại Việt Nam và nhiều nước, các dược chất đồng vị phóng xạ không phổ biến, cho nên, việc nghiên cứu sử dụng các hoạt chất sẵn có khác làm nội chuẩn của phương pháp sẽ thích hợp hợp. Trên thiết bị MS, không thể thực hiện hai điều kiện phổ khối khác nhau tại cùng một thời điểm xác định. Vì vậy, chất nội chuẩn phải có cơ chế và điều kiện ion hóa tương tự như cơ chế và điều kiện ion hóa của hoạt chất cần phân tích, chỉ có thể khác với hoạt chất cần phân tích ở giá trị số khối ion ban đầu; mức năng lượng phân mảnh ion và số khối của ion con tạo
thành (nếu có). Chất nội chuẩn cho phương pháp LC-MS/MS nên được lựa chọn trong số các chất có cùng nhóm chức và có tính chất hóa học gần giống với hoạt chất cần phân tích để có cùng cơ chế ion hóa tại nguồn ESI và có độ thu hồi không quá chênh lệch so với chất cần phân tích khi áp dụng cùng một quy trình xử lý mẫu.
- Phân tích phổ khối lượng của các chất ĐPĐQ: Các ĐPĐQ có cùng công thức hóa học, chỉ khác nhau ở vị trí trong không gian của các nhóm thế liên kết với nguyên tử C*. Do vậy, khi ion hóa ở nguồn ESI đều tạo ra các ion ban đầu có số khối giống nhau nên không thể phân biệt được bằng phương pháp phổ khối lượng. Để phân tích các ĐPĐQ bằng phương pháp LC-MS/MS cần phải nghiên cứu điều kiện sắc ký lỏng phù hợp để phân tách các ĐPĐQ trước khi tiến hành phân tích phổ khối lượng.
- Phổ khối MS/MS của atenolol: Các thiết bị khối phổ kiểu tứ cực chập ba ít được ứng dụng trong nghiên cứu xác định cấu trúc các chất do thiết bị phổ kiểu tứ cực chập ba thường có độ nhạy, độ chính xác phổ khối không cao. Thiết bị phổ khối kiểu tứ cực chập ba thường chỉ được sử dụng để định tính, định lượng các chất dựa trên kết quả so sánh các vạch phổ của mẫu thử với vạch phổ của chất chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Trong đa số các trường hợp phân tích bằng thiết bị phổ khối kiểu tứ cực chập ba, việc xác định cấu trúc của các vạch phổ trên phổ đồ là khá khó khăn. Tuy vậy, trên phổ đồ phân mảnh ATN (Hình 3.23) có thể dự đoán một số vạch phổ có m/z = 225 (phù hợp với cấu trúc [ATN-isopropyl+H]+), m/z = 208 (phù hợp với [ATN-isopropyl- NH3]+), m/z = 190 (phù hợp với [ATN-isopropyl-NH3-H2O+2H]+), hay m/z = 178 và m/z = 145 là các vạch phổ đặc trưng cho quá trình phân mảnh ATN. Các phương pháp LC-MS/MS nghiên cứu trong luận án, sử dụng cặp ion mẹ - con có tỷ số m/z lần lượt là 267 và 190 để định tính, định lượng ATN trong mẫu tương tự phương pháp LC- MS/MS của Raja Reddy Kallem [149] hay Sridharan D [173].
Về phương pháp LC-MS/MS phân tích các đồng phân ATN trong huyết tương Atenolol có SKD không cao, sau khi uống liều đơn 50 mg nồng độ ATN toàn phần cực đại trong huyết tương người thấp, chỉ khoảng 300 ± 50 ng/ml [21], [43] vì vậy theo quy định đối với các phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [45], [68], [184], [199] để định lượng ATN và các đồng phân trong huyết tương người, phương pháp phân tích phải có độ nhạy tốt, giới hạn định lượng của phương pháp tối thiểu phải đạt 5 – 10 ng/ml đối với ATN toàn phần hoặc từ 2,5 – 5 ng/ml đối với các ĐPĐQ của ATN. Mặt khác, mẫu huyết tương lại có nhiều thành phần tạp chất, các đồng phân R- ATN, S-ATN có tính chất hóa lý giống nhau nên việc phân tích, định lượng ATN và
các ĐPĐQ trong huyết tương người gặp khó khăn hơn nhiều so với phương pháp phân tích trong chế phẩm thuốc. Chính vì vậy, số lượng các phương pháp phân tích ATN và các ĐPĐQ được công bố không nhiều. Đa số các phương pháp đã được công bố đều là các phương pháp định lượng ATN toàn phần trong dịch sinh học [21], [134], [149], [173], [204]. Các phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS của Raja Reddy Kallem [149], Sridharan D [173] hay phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang của Yilmaz B. và cộng sự [204] có LOQ khoảng 10 ng/ml, đáp ứng yêu cầu nhưng chỉ phân tích được ATN toàn phần không xác định được các ĐPĐQ của ATN do sử dụng các phương pháp sắc ký thông thường không sử dụng các tác nhân chọn lọc đối quang để có thể phân tách được các ĐPĐQ. Chỉ có một số ít các phương pháp phân tích ĐPĐQ của ATN trong dịch sinh học được công bố [57], [64], [118], [156]. Tuy nhiên, các phương pháp này lại chưa được tiến hành thẩm định đầy đủ theo quy định như các phương pháp của Egginger G. [57], Enquist M. [64], Rosseel MT [156] hoặc không có đủ độ nhạy cần thiết để xác định được chính xác nồng độ các đồng phân ATN trong huyết tương người tại các thời điểm 12 – 24 giờ sau khi sử dụng thuốc (tương đương với khoảng thời gian bằng 5 – 7 t1/2 của thuốc) như phương pháp của Li X. [118] hay phương pháp của Rosseel MTvà cộng sự [156].
Kết hợp nguyên lý phân tách trực tiếp các ĐPĐQ bằng cột HPLC chứa pha tĩnh chọn lọc đối quang với các ưu điểm nổi bật của phương pháp phân tích phổ khối như độ đặc hiệu-chọn lọc; độ nhạy tốt, phương pháp LC-MS/MS nghiên cứu trong luận án đã phân tích được đồng thời các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương ở nồng độ rất thấp (tới ng/ml) với độ đúng, độ chính xác cao. So với phương pháp LC-MS/MS của Raja Reddy Kallem [149], Sridharan D [173], phương pháp nghiên cứu trong luận án không những có giới hạn định lượng dưới thấp hơn từ 2 – 10 lần mà còn có thể phân tích đồng thời các đồng phân đối quang R-ATN và S-ATN. Trong khi đó phương pháp của các tác giả Reddy Kallem [149] và Sridharan D [173] do không sử dụng các tác nhân chọn lọc đối quang nên không có khả năng phân biệt được các ĐPĐQ, chỉ có thể định lượng được ATN toàn phần.
So với các phương pháp HPLC phân tích ĐPĐQ của Egginger G. [57], Enquist M. [64] phương pháp phân tích trong luận án có thời gian phân tích ngắn hơn nhiều nhưng độ phân giải giữa các pic đồng phân lại lớn hơn. Phương pháp phân tích của Egginger G. [57], Enquist M. [64] có thời gian phân tích kéo dài hơn 20 phút, độ phân giải giữa các pic đồng phân chỉ đạt từ 1,5 đến xấp xỉ 2. Phương pháp phân tích nghiên cứu trong
luận án, có thời gian phân tích chỉ khoảng 8 phút cho một lần sắc ký và độ phân giải giữa các pic lớn hơn 5. Các pic phân tách hoàn toàn nên độ đúng, độ chính xác của phương pháp đảm bảo. Hơn nữa, thời gian phân tích ngắn rất thích hợp cho việc phân tích một số lượng lớn các mẫu trong các nghiên cứu SKD và TĐSH.
Trên sắc ký đồ phân tích mẫu LLOQ (mẫu có nồng độ thấp nhất thuộc đường chuẩn) với nồng độ R-ATN, S-ATN khoảng 2,5 ng/ml (Hình 3.28d) giá trị S/N của các pic R-ATN và S-ATN lần lượt là 90 và 140, chứng tỏ giá trị LOQ (tương ứng với S/N
= 10) nhỏ hơn khoảng 9 – 14 lần so với giá trị LLOQ. Do vậy, phương pháp LC- MS/MS nghiên cứu trong luận án sử dụng đầu dò khối phổ tứ cực chập ba để phát hiện, định lượng các ĐPĐQ của ATN có giá trị LOQ nhỏ hơn nhiều so với phương pháp HPLC của Egginger G. [57] và Enquist M. [64]. Giá trị LLOQ nhỏ, cho phép phương pháp LC-MS/MS đã nghiên cứu có thể xác định được nồng độ các đồng phân ATN trong các mẫu huyết tương người ở xa thời điểm dùng thuốc, ứng dụng phù hợp trong các nghiên cứu SKD, TĐSH và DĐH các thuốc ATN dạng racemic hoặc dạng đơn ĐPĐQ trên người.
So với các phương pháp HPLC của các tác giả Egginger G. [57], Li X. [118] hay Rosseel MT [156] phải thực hiện phản ứng với các thuốc thử để tạo dẫn chất phi đối quang trước khi phân tích, phương pháp LC-MS/MS đã nghiên cứu tiến hành phân tách trực tiếp các đồng phân đối quang ATN trên cột sắc ký chứa pha tĩnh chọn lọc đối quang mà không cần phải có phản ứng tạo dẫn chất. Việc phải thực hiện phản ứng tạo dẫn chất trước khi phân tích không những phức tạp, tốn thời gian mà còn ảnh hưởng đến độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích do hiệu suất của phản ứng phụ thuộc vào nhiều yếu tố cả chủ quan lẫn khách quan.
Phương pháp phân tích LC-MS/MS nghiên cứu trong luận án đã được thẩm định đầy đủ đạt yêu cầu theo hướng dẫn của FDA-Mỹ và EMA về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học [68], [184]. Phương pháp đã thẩm định có giá trị LLOQ là 2,5 ng/ml bằng khoảng 1/60 Cmax với mức liều thông thường 50 mg, có khoảng nồng độ tuyến tính lớn (2,5 ng/ml – 500 ng/ml) với độ đúng, độ chính xác cao và lặp lại phù hợp để phân tích xác định đồng thời các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương người.
Về phương pháp LC-MS/MS phân tích ATN toàn phần trong huyết tương
So với các phương pháp HPLC sử dụng đầu dò UV hoặc huỳnh quang để định lượng ATN toàn phần trong các mẫu HT của các tác giả Abreu LR. [21] hay Mohamed S.
[134], phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần nghiên cứu trong luận án
có giá trị LLOQ nhỏ hơn nhiều lần (từ 5 đến 20 lần). Trên các sắc ký đồ phân tích các mẫu LLOQ nồng độ 5 ng/ml (Hình 3.30b), giá trị S/N của pic ATN vào khoảng 150, chứng tỏ giá trị LOQ của phương pháp (tương ứng với mẫu có S/N = 10) đạt xấp xỉ 0,5 ng/ml (bằng 1/10 – 1/15 nồng độ LLOQ). Với giá trị LOQ này, phương pháp LC- MS/MS định lượng ATN toàn phần nghiên cứu trong luận án có độ nhạy tốt hơn khoảng 10 lần so với các phương pháp phân tích của các tác giả Sridharan D. [173] và Yilmaz B. [204]. Với các giá trị LOQ và LLOQ nhỏ, phương pháp đã nghiên cứu trong luận án, có thể xác định được nồng độ các đồng phân ATN trong các mẫu huyết tương người ở xa thời điểm dùng thuốc và phù hợp để ứng dụng trong các nghiên cứu SKD, TĐSH và DĐH các thuốc ATN racemic trên người.
Phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong HT nghiên cứu trong luận án có giá trị LLOQ tương đương với phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong HT của tác giả Raja Reddy Kallem [149]. Tuy vậy, phương pháp phân tích nghiên cứu trong luận án có thời gian phân tích rất ngắn (khoảng 2 phút) nhanh hơn nhiều so với phương pháp phân tích của Raja Reddy Kallem. Thời gian phân tích ngắn thích hợp hơn cho việc phân tích một số lượng lớn các mẫu trong các nghiên cứu SKD và TĐSH.
Các kết quả thẩm định cũng cho thấy, phương pháp phân tích LC-MS/MS nghiên cứu trong luận án đáp ứng các yêu cầu của phương pháp phân tích thuốc trong dịnh sinh học theo các hướng dẫn của FDA-Mỹ và EMA [68], [184].
4.3.1. Kết quả phân tích ĐPĐQ của ATN trong HT và sinh khả dụng các thuốc
Phân tích atenolol và các đồng phân đối quang trong huyết tương người
- Trên SKĐ phân tích các mẫu huyết tương NTN và bệnh nhân sử dụng các thuốc ATN racemic (trừ các mẫu HT tại thời điểm trước khi sử dụng thuốc) đều xuất hiện các pic tương ứng với các pic đồng phân đối quang R-ATN và S-ATN trong các mẫu chuẩn. Trên SKĐ phân tích các mẫu huyết tương NTN sử dụng các thuốc S-ATN chỉ xuất hiện một pic tương ứng với pic S-ATN trong các mẫu chuẩn. Như vậy phương pháp LC-MS/MS đã nghiên cứu có tính đặc hiệu-chọn lọc cao, không bị ảnh hưởng bởi các thuốc khác sử dụng phối hợp.
- Kết quả phân tích cũng cho thấy không có sự chuyển dạng hỗ biến giữa các đồng phân đối quang R-ATN và S-ATN trên in vivo, tương tự kết quả nghiên cứu Stoschitzky và cộng sự [177].
- Tất cả các mẫu huyết tương NTN và bệnh nhân sau khi uống thuốc đều được phân
tích và có nồng độ trong khoảng tuyến tính đã khảo sát từ 2,5 ng/ml đến 500 ng/ml.
Giá trị nồng độ R-ATN, S-ATN cực đại trong huyết tương NTN (min = 115 ng/ml, max = 331 ng/ml; trung bình khoảng 200 ng/ml) cao hơn nhiều lần giá trị LLOQ và bằng từ 1/4 đến 1/2 giá trị ULOQ của phương pháp. Do vậy, phương pháp LC-MS/MS đã nghiên cứu có thể áp dụng trong nhiều nghiên cứu SKD và đánh giá TĐSH các thuốc ATN dạng racemic hoặc S-ATN có hàm lượng khác nhau.
Kết quả khảo sát sinh khả dụng các thuốc atenolol
Từ kết quả phân tích xác định nồng độ ATN và ĐPĐQ trong các mẫu, đồng thời xác định được các thông số DĐH của thuốc ATN racemic và thuốc S-ATN trên NTN Việt Nam như sau:
Thông số Thuốc
Cmax
(ng/ml)
Tmax
(giờ)
AUC0-24 giờ
(ng/ml.giờ)
AUC0-∞
(ng/ml.giờ)
T1/2
(giờ) Atenolol
50 mg
Chứng 388,4 2,16 2905,3 3137,0 5,37
Thử 360,5 2,25 2765,3 2909,9 5,28
S-Atenolol 25 mg
Ấn Độ 259,3 2,31 1779,9 1906,1 5,24
Hàn Quốc 196,5 1,92 1348,7 1429,2 5,19
- Đối với các thuốc atenolol racemic: Nồng độ R-ATN và S-ATN trong mỗi mẫu huyết tương chênh lệch nhau không nhiều. Các thông số DĐH của các đồng phân R-ATN và S-ATN trên NTN (Bảng 3.43) tương đương nhau chứng tỏ SKD các đồng phân đối quang ATN tương tự và không phụ thuộc vào nhau. Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu Stoschitzky và cộng sự [177].
- Các thông số DĐH của các thuốc ATN racemic trên NTN Việt Nam đã lần đầu tiên được xác định và công bố. Giá trị Tmax, T1/2 của các thuốc ATN racemic tương tự như số liệu nghiên cứu của các tác giả Chang M.J. và Luis Renato trên nam tình nguyện viên Hàn Quốc và Brasil [21], [43]. Giá trị Cmax, AUC của các thuốc ATN racemic trên NTN Việt Nam cao hơn so với các số liệu nghiên cứu của các tác giả Chang M.J. [43]
và Abreu L.R. [21] có thể do các nguyên nhân như nhóm NTN tham gia nghiên cứu trong luận án có chỉ số trọng lượng cơ thể nhỏ hơn hoặc do sự khác nhau về kỹ thuật, điều kiện phân tích và số lượng NTN tham gia nghiên cứu.
- Các thông số DĐH của các thuốc S-ATN lần đầu được công bố cho thấy không có sự khác biệt về tốc độ hấp thu và thải trừ giữa các ĐPĐQ của ATN. Giá trị Tmax, T1/2 của S-ATN, R-ATN và R,S-ATN tương tự nhau. Tuy nhiên, giá trị Cmax và AUC của S- ATN trong các thuốc đơn đồng phân (chỉ chứa S-ATN) cao hơn có ý nghĩa so với giá