4.1. PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM
4.1.1. Phân tích đồng phân đối quang atenolol bằng các phương pháp HPLC, CE
- Phương pháp CE sử dụng tác nhân chọn lọc hoạt quang nhóm dẫn chất β-CD mang điện tích (CM-β-CD) trong dung dịch điện ly nền để tương tác tạo phức “lồng” với các đồng phân R-ATN và S-ATN. Sự hình thành “phức lồng” giữa các ĐPĐQ của ATN và CM-β-CD liên quan đến quá trình “lồng” các gốc thân dầu của phân tử ATN vào “hốc rỗng” của các CD thay thế cho phân tử dung môi ở phía trong của hốc rỗng và phụ thuộc vào cấu trúc không gian của các đồng phân[152], [196]. Ngoài tương tác kỵ nước với hốc rỗng của phân tử CD, các ĐPĐQ do vị trí không gian của các nhóm thế quanh nguyên tử C* của ATN khác nhau nên tương tác hydro với các nhóm hydroxyl ở bề mặt hốc kỵ nước của CM-β-CD cũng khác nhau. Vị trí hình thành liên kết hydro giữa các ĐPĐQ của ATN với CM-β-CD bao gồm:
Trong hai đồng phân, R-ATN có khả năng hình thành cả 3 liên kết hydro với CM-β- CD, còn S-ATN do sự cản trở không gian của cấu trúc chỉ có thể hình thành một liên kết hydro ở vị trí nhóm chức amin với CM-β-CD. Vì vậy, phức hợp giữa R-ATN và CM-β-CD có hằng số bền lớn hơn nên có thời gian di chuyển lâu hơn trên điện di đồ.
- Trong 2 phương pháp HPLC, một phương pháp sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang có bản chất là protein (cột Chiralpak CBH) liên kết với pha rắn silicagen tương
tác với các ĐPĐQ của ATN thông qua các nhóm chức đặc hiệu và vòng xoắn thứ cấp của phân tử protein; phương pháp còn lại sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh silicagen liên kết với tác nhân hoạt quang kiểu Pirkle ((S)-indoline-2-carboxylic acid và (R)-1-(α- naphthyl)ethylamin), tạo phức hợp với ĐPĐQ dựa trên tương tác ba điểm trong đó một tương tác là liên kết π-π (cột Chirex 3022). Do vậy, phức hợp giữa các ĐPĐQ của ATN và các tác nhân chọn lọc hoạt quang trong mỗi phương pháp sẽ khác nhau và thứ tự rửa giải của các phức hợp trên SKĐ của mỗi phương pháp cũng khác nhau.
Phương pháp HPLC phân tích các ĐPĐQ của ATN với cột Chirex 3022 cùng hệ pha động n-hexan – dichloromethan – MeOH – TFA (57,5:35:7,5:0,2), các đồng phân R- và S-ATN tách khỏi nhau với độ phân giải Rs 2. Tuy vậy, thời gian phân tích kéo dài (hơn 20 phút); pha động sắc ký có chứa các dung môi hữu cơ không phân cực, không đồng tan với nước, dễ bay hơi chiếm tỷ lệ lớn nên thời gian ổn định hệ thống sắc ký kéo dài và khó áp dụng để phân tích hoạt chất trong dung dịch nước. Phương pháp HPLC phân tích với cột sắc ký Chiralpak CBH cùng hệ pha động chứa 2-propanol – dung dịch đệm amoni acetat 10 mM pH 5,9 (10 : 90) có thời gian phân tích ngắn (chỉ 7,5 phút) nhưng các pic S-ATN và R-ATN tách nhau hoàn toàn với Rs > 5. Mặt khác, phương pháp HPLC với cột Chiralpak CBH có kiểu sắc ký pha đảo, pha động sắc ký chứa dung môi hữu cơ phân cực mạnh và dung dịch đệm chiếm tỷ lệ lớn nên có thể áp dụng để phân tích các ĐPĐQ của ATN trong nhiều loại mẫu.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp HPLC với cột Chiralpak CBH và phương pháp CE với tác nhân hoạt quang CM-β-CD trong dung dịch điện ly nền đều có khả năng tách hoàn toàn hai đồng phân R-ATN, S-ATN với độ phân giải lần lượt là 5,30 (Bảng 3.2) và 2,74 (Bảng 3.8), đáp ứng yêu cầu Rs 2,0. Giá trị độ đúng, độ chính xác của hai phương pháp đều trong khoảng 98,0% - 102,0% (Bảng 3.6, Bảng 3.7, Bảng 3.11) với RSD < 2% (Bảng 3.4, Bảng 3.9, Bảng 3.10). Trong khoảng nồng độ khảo sát, các phương pháp đều có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa giá trị diện tích pic với nồng độ dược chất có trong mẫu (Bảng 3.3, Bảng 3.9).
Kết quả ứng dụng phương pháp HPLC và CE xác định hàm lượng trung bình ATN và các ĐPĐQ trong mẫu thuốc Atenolol Stada (Bảng 3.12) cũng cho thấy hai phương pháp có độ đúng và độ chính xác tương đương nhau. Do vậy, hai phương pháp đều có thể ứng dụng trong kiểm nghiệm, kiểm tra chất lượng các thuốc ATN dạng racemic và dạng đơn đồng phân đối quang S-ATN.
Kết quả phân tích thống kê cũng cho thấy các phương pháp HPLC và CE nghiên
cứu trong luận án, không những xác định được từng ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm thuốc mà còn xác định được hàm lượng ATN toàn phần trong mẫu dựa trên tổng hàm lượng của các đồng phân. Hàm lượng ATN toàn phần xác định bằng các phương pháp HPLC, CE khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với phương pháp HPLC định lượng ATN toàn phần của Dược điển Mỹ 38 (Bảng 3.12).
So với phương pháp HPLC, phương pháp CE tốn ít hóa chất, thuốc thử hơn. Dung dịch điện ly nền cũng ít độc hại với môi trường và an toàn cho kiểm nghiệm viên hơn.
Tác nhân chọn lọc hoạt quang được thêm vào dung dịch điện ly nền nên việc thay đổi loại và nồng độ tác nhân hoạt quang khi khảo sát lựa chọn điều kiện điện di phân tách các ĐPĐQ tương đối dễ thực hiện. Trong khi đó phương pháp HPLC sử dụng các cột sắc ký chứa pha tĩnh hoạt quang, mỗi loại pha tĩnh hoạt quang chỉ thích hợp cho phân tách một số ĐPĐQ nhất định, nên việc khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký bị bó hẹp và khó khăn hơn. Tuy vậy, thiết bị CE không phổ biến ở các phòng thí nghiệm tại Việt Nam bằng thiết bị HPLC, kết quả thẩm định cũng cho thấy, phương pháp CE có khoảng tuyến tính hẹp hơn; độ ổn định, độ lặp lại kết quả phân tích và đặc biệt là độ nhạy kém hơn so với phương pháp HPLC. Giá trị LOD và LOQ của phương pháp HPLC nhỏ hơn khoảng 50 – 70 lần so với phương pháp CE (giá trị LOQ đối với đồng phân R-ATN của các phương pháp HPLC và CE lần lượt là 0,273 ng/ml và khoảng 20 ng/ml, trong đó LOQ của phương pháp HPLC xác định bằng thực nghiệm – Mục 3.1.1.2g, còn LOQ của phương pháp CE ước đoán dựa trên giá trị nhiễu đường nền của điện di đồ mẫu giả dược – Hình 3.17). Sở dĩ phương pháp CE có độ nhạy kém hơn là do đầu dò có thể tích nhỏ, quang lộ nhỏ chỉ bằng đường kính trong của cột mao quản và thể tích tiêm mẫu ít hơn. Do vậy để xác định tạp R-ATN trong nguyên liệu hay chế phẩm S-ATN thì phương pháp HPLC nên là sự lựa chọn hàng đầu.
Các kết quả thực nghiệm cũng cho thấy, phương pháp HPLC và CE định lượng các đồng phân ATN nghiên cứu trong luận án có nhiều điểm tương đồng và cải tiến hơn so với các nghiên cứu đã công bố ở nước ngoài. Phương pháp CE sử dụng tác nhân chọn lọc hoạt quang β-CD trong dung dịch điện ly nền để phân tích các đồng phân đối quang ATN của Wei Wang [195] và Wuhong Li [201] có thời gian di chuyển của các đồng phân tương đối dài. Tổng thời gian cho một lần điện di trong nghiên cứu của Wuhong Li [201] và Wang [195] lần lượt là 20 và 40 phút. Phương pháp CE nghiên cứu trong luận án, thời gian di chuyển của các đồng phân đối quang ATN đã được rút ngắn xuống dưới 10 phút song độ phân giải vẫn đạt yêu cầu của phép thử
định lượng. Thời gian một lần phân tích ngắn tạo thuận lợi cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc trên thực tế.
Phương pháp HPLC định lượng đồng phân đối quang ATN đã được các tác giả công bố [42], [44], [136], [163], [188] đều có giá trị độ phân giải giữa các pic R-ATN và S-ATN không cao (chỉ từ 1,5 đến xấp xỉ 2,0). Các pic R- và S-ATN tách không hoàn toàn, ảnh hưởng đến độ đúng, chính xác của phương pháp phân tích. Phương pháp HPLC của Sami El Deeb [158] mặc dù có độ phân giải tốt (Rs 3), các pic đồng phân ATN tách nhau hoàn toàn song thời gian phân tích tương đối dài (tới 40 phút) không thích hợp để phân tích nhiều mẫu trong ngày. Phương pháp HPLC định lượng các ĐPĐQ của ATN sử dụng cột sắc ký Chiralpak CBH chứa pha tĩnh đối quang cellobiohydrolase nghiên cứu trong luận án, các pic đồng phân tách nhau hoàn toàn, độ phân giải của các pic đạt hơn 5 song thời gian phân tích một mẫu chỉ mất 7,5 phút.
Trong số các phương pháp HPLC định lượng ĐPĐQ của ATN đã được công bố, chỉ có phương pháp của Sami El Deeb [158] xác định được giới hạn tạp ĐPĐQ liên quan trong nguyên liệu (giá trị LOD cho R-ATN bằng 0,08% so với hàm lượng S- ATN). Phương pháp HPLC còn lại của các tác giả Chandra Mohan [42], Cheng B [44], Morante Zarcero [136], Santoro M.I [163], Torul H [188] giá trị LOD của phương pháp không đáp ứng yêu cầu. So với phương pháp của Sami El Deeb [158], phương pháp HPLC nghiên cứu trong luận án có các giá trị LOD, LOQ lần lượt là 0,083 và 0,273 ng/ml (Mục 3.1.1.2g) thấp hơn khá nhiều. Giá trị LOQ = 0,273 ng/ml cho phép xác định chính xác hàm lượng tạp chất R-ATN có trong mẫu với mức nồng độ từ 0,02% trở lên, đáp ứng tốt yêu cầu kiểm tra giới hạn R-ATN trong các mẫu nguyên liệu hoặc chế phẩm thuốc S-ATN ngay cả ở mức giới hạn rất thấp ( 0,1%).
Các phương pháp HPLC của Morante Z. [136], Santoro M.I [163] và Torul H [188] đều sử dụng kiểu sắc ký pha thuận, pha động có thành phần chính là các dung môi hữu cơ không phân cực nên khó áp dụng để phân tích các mẫu ATN hòa tan trong dung môi phân cực. Phương pháp của Chandra Mohan và cộng sự [42] phân tích trên cột sắc ký Chiral AGP có kiểu sắc ký pha đảo, thích hợp để phân tích các mẫu ATN trong môi trường phân cực, song do pha động chứa muối vô cơ nên không có khả năng ghép nối với đầu dò MS. Phương pháp HPLC trong luận án mặc dù có kiểu sắc ký pha đảo nhưng pha động có dung môi hữu cơ phân cực và dung dịch đệm amoni acetat không những thích hợp để phân tích ATN trong nhiều loại mẫu khác nhau mà còn có thể ghép nối với đầu dò MS để phân tích ATN và các ĐPĐQ trong dịch sinh học.