1.3. ATENOLOL, ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.3.3. Các phương pháp phân tích atenolol và đồng phân đối quang
1.3.3.2. Phân tích atenolol và đồng phân đối quang trong dịch sinh học
Atenolol có SKD không cao, chỉ khoảng 45% và phụ thuộc nhiều vào yếu tố cá thể [5], [27] nên nồng độ dược chất trong HT thường không cao và dao động mạnh giữa các cá thể. Một số nghiên cứu SKD, DĐH của ATN racemic đã được công bố cho thấy, nồng độ ATN cực đại trong HT người chỉ vào khoảng 300 ± 50 ng/ml [21], [43]
do vậy phân tích, định lượng ATN nói chung cũng như các ĐPĐQ của ATN nói riêng trong dịch sinh học gặp nhiều khó khăn.
Để định lượng ATN trong HT người, phương pháp phân tích phải có giới hạn định lượng tối thiểu đạt 5 – 10 ng/ml đối với ATN toàn phần (ATN racemic) hoặc từ 2,5 – 5 ng/ml đối với các ĐPĐQ của ATN.
Nhiều phương pháp phân tích ATN toàn phần trong dịch sinh học đã được các tác giả công bố, còn các phương pháp định lượng các ĐPĐQ của ATN trong dịch sinh học được công bố trong thời gian qua không nhiều. Yilmaz B., Angier MK và các cộng sự đã tiến hành định lượng ATN trong HT bằng phương pháp GC-MS [29], [203]. Do ATN có nhóm chức phân cực mạnh nên việc phân tích bằng GC không đạt hiệu quả cao. Để giảm mức độ phân cực của ATN các tác giả đã thực hiện phản ứng tạo dẫn chất với các thuốc thử như pentafluoropropionic anhydrid [29] hoặc N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamid [203]. Tuy vậy, phản ứng tạo dẫn chất của ATN với thuốc thử có hiệu suất không cao, nên vậy giới hạn phát hiện của phương pháp chỉ vào khoảng 50–100 ng/ml.
Để phân tích ATN trong dịch sinh học các tác giả chủ yếu thường sử dụng phương pháp HPLC kết nối với đầu dò UV [134]; huỳnh quang [21], [204] hoặc MS [149], [173]. Ngoài ra, một số tác giả cũng nghiên cứu phân tích bằng phương pháp CE với đầu dò UV hoặc DAD [64], [95]. Trong phương pháp CE, do thể tích tiêm mẫu nhỏ và do đặc điểm của đầu dò (UV, DAD) thường có quang lộ rất nhỏ (bằng đường kính trong của cột mao quản) nên độ nhạy của phương pháp không cao (giá trị LOQ khoảng 100 – 200 ng/ml).
Để phân tích các ĐPĐQ của ATN trong dịch sinh học, nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC với pha tĩnh đối quang (tách trực tiếp) hoặc phản ứng với các thuốc thử để tạo dẫn chất phi đối quang trước khi tiến hành phân tích bằng phương pháp HPLC sử dụng các pha tĩnh thông thường (tách gián tiếp).
Tóm tắt một số phương pháp HPLC phân tích ATN toàn phần hoặc ĐPĐQ của ATN trong dịch sinh học được trình bày ở các Bảng 1.13 và Bảng 1.14.
Bảng 1.13. Một số phương pháp HPLC định lượng atenolol trong dịch sinh học Tóm tắt phương pháp phân tích TLTK - Phương pháp: LC-MS (APCI – MS)
- Điều kiện sắc ký: Cột C18; 100 x 4,6 mm; 5 àm. Pha động: MeCN - dung dịch acid formic 0,5% (60 : 40). Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
- Xử lý mẫu: Chiết SPE (cột C18; 100 mg/ml)
- Khoảng tuyến tính: 20 – 12000 ng/ml, LOQ: 5 ng/ml (S/N > 10)
[173]
- Phương pháp LC-MS (ESI – MS)
- Điều kiện sắc ký: Hypurity Advance C18; 50 x 2,1 mm; 1,8 àm. Pha động:
MeCN - dung dịch đệm 5 mM amoni acetat (85 : 15). 1,0 ml/phút.
- Xử lý mẫu: Chiết lỏng – lỏng (tert-butyl ethyl ether) - Khoảng tuyến tính: 5 – 500 ng/ml, LLOQ: 5 ng/ml.
[149]
- Phương pháp HPLC-huỳnh quang, Ex: 258 nm; Em: 300 nm
- Điều kiện sắc ký: Cột C18; 250 x 4,6 mm; 10 àm. Pha động: MeCN - MeOH - dung dịch đệm phosphat 0,01 M (pH 6,0) + 0,1% natri dodecyl sulfat (15 : 60 : 25). Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Xử lý mẫu: Chiết lỏng – lỏng (hexan : n-butanol = 1 : 1) - Khoảng tuyến tính: 25 – 800 ng/ml, LLOQ: 25 ng/ml.
[21]
- Phương pháp: HPLC-UV (225 nm)
- Điều kiện sắc ký: Cột CN; 250 x 4,6 mm; 10 àm. Pha động chứa MeOH - dung dịch đệm KH2PO4 10 mM (30 : 70). Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Xử lý mẫu: Tủa protein với MeCN
- Khoảng tuyến tớnh: 0,1 – 100 àg/ml, LOQ: 100 ng/ml
[134]
- Phương pháp: HPLC-huỳnh quang, Ex: 276 nm; Em: 296 nm
- Điều kiện sắc ký: Cột C18; 250 x 4,6 mm; 10 àm. Pha động: 0,1% acid trifloroacetic trong MeOH - H2O (1 : 1). Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Xử lý mẫu: Chiết lỏng – lỏng (chloroform : n-butanol tỷ lệ 4 : 1) - Khoảng tuyến tính: 5 – 150 ng/ml, LOQ: 5 ng/ml.
[204]
Nhận xét:
- ATN dễ tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực, nên đa số các tác giả lựa chọn kỹ thuật chiết lỏng – lỏng với dung môi hữu cơ để chiết ATN trong HT.
- Có thể định lượng ATN trong các mẫu sinh học bằng phương pháp HPLC với đầu dò UV hoặc huỳnh quang (HQ). Phương pháp phân tích sử dụng đầu dò HQ có độ nhạy cao hơn so với phương pháp sử dụng đầu dò UV. Tuy vậy, các phương pháp này đều có độ nhạy kém hơn LC-MS và độ nhạy chưa phù hợp để xác định được nồng độ
ATN trong các mẫu HT người tham gia nghiên cứu SKD/ TĐSH chế phẩm ATN.
Bảng 1.14. Một số nghiên cứu định lượng ĐPĐQ của ATN trong dịch sinh học bằng phương pháp HPLC (*) ĐKSK: Điều kiện sắc ký Tóm tắt phương pháp Loại mẫu LOQ TLTK - ĐKSK*: Cột Chiral AGP. Pha động chứa MeCN-dung
dịch đệm phosphat 0,01M (pH 7,1); tỷ lệ 25 : 75. Tốc độ dòng 1,0 nl/phút. Đầu dò: Huỳnh quang (HQ)
- Xử lý mẫu: Chiết lỏng – lỏng với hỗn hợp dung môi dichloromethan : heptanfluorobutanol (97 : 3)
HT, nước
tiểu
6 ng/ml
[64]
- ĐKSK: Cột C18. Pha động: MeCN-dung dịch đệm acetat 0,01M (pH 7) tỷ lệ 50 : 50. Tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Đầu dò: HQ; Ex: 227 nm; Em: 310 nm.
- Xử lý mẫu: Chiết lỏng – lỏng với dichloromethan : heptanfluorobutanol (97 : 3), tạo dẫn chất với (+)-1-(9- fluorenyl)ethyl chloroformat
HT, nước
tiểu
10 ng/ml
[156]
- ĐKSK: Cột (R,R)-diaminocyclohexan-dinitrobenzoyl.
Pha động: dichloromethan-MeOH (98 : 2). Đầu dò: HQ - Xử lý mẫu: Chiết lỏng – lỏng bằng dichloromethan chứa 5% n-butanol, tạo dẫn chất với oxazolidin-2
HT 5 ng/ml
[57]
- ĐKSK: Cột C18. Pha động: dung dịch đệm phosphat- MeOH-MeCN (50 : 20 : 30), tốc độ dòng 0,5 ml/phút.
Đầu dò: UV 254 nm
- Xử lý mẫu: Chiết lỏng – lỏng, tạo dẫn chất với 2,3,4,6- tetra-O-acetyl-β-D-glycopyranosyl isothiocyanat
Dịch đồng nhất tế bào gan
chuột
0,145 àg/ml (S/N:10)
[118]
Nhận xét:
- Tương tự các phương pháp HPLC định lượng ATN toàn phần trong dịch sinh học, để chiết ATN và ĐPĐQ trong dịch sinh học các tác giả cũng lựa chọn kỹ thuật chiết lỏng – lỏng với dicloromethan hoặc dẫn chất của butanol [57], [64], [156].
- Đề định lượng các DPĐQ của ATN trong mẫu sinh học, các tác giả đều sử dụng phương pháp HPLC với cột pha tĩnh đối quang [57], [64] hoặc phương pháp HPLC gián tiếp sử dụng cột pha đảo và tác nhân hoạt quang được phản ứng tạo phức hợp phi đối quang với các ĐPQH của ATN ở ngoài hệ thống sắc ký [118], [156]. So với các phương pháp HPLC gián tiếp, phương pháp HPLC phân tích ĐPĐQ trực tiếp bằng cột pha tĩnh đối quang có quá trình xử lý mẫu đơn giản hơn và giá trị LOD của phương pháp nhỏ hơn.