Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng ĐPĐQ của ATN trong HT

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.2. PHÂN TÍCH ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN TRONG HUYẾT TƯƠNG

3.2.1. Định lượng các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương bằng LC-MS/MS

3.2.1.2. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng ĐPĐQ của ATN trong HT

Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn R,S-ATN nồng độ chính xác khoảng 100 ng/ml theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọn ở trên.

Ghi lại các SKĐ, xác định các thông số đặc trưng của mỗi pic và tỷ lệ diện tích giữa các pic hoạt chất so với pic nội chuẩn.

Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống sắc ký được trình bày trong Bảng 3.18.

Bảng 3.18. Độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS Số thứ tự

R-ATN S-ATN IS Tỷ lệ diện tích

tR

(min)

diện tích

tR

(min)

diện tích

tR

(min)

diện

tích R-ATN/IS S-ATN/IS 1 3,63 167916 5,78 151703 4,25 244252 0,687 0,621 2 3,65 156850 5,78 142801 4,27 232064 0,676 0,615 3 3,63 163211 5,78 148162 4,27 234482 0,696 0,632 4 3,63 165770 5,78 150949 4,27 239252 0,693 0,631 5 3,63 166631 5,80 150260 4,27 241650 0,690 0,622 6 3,63 166396 5,78 151728 4,27 240294 0,692 0,631 Trung bình 3,63 164462 5,78 149267 4,27 238666 0,689 0,625 SD 0,01 4040 0,01 3430 0,01 4565 0,007 0,007 RSD (%) 0,2 2,5 0,1 2,3 0,2 1,9 1,0 1,1

Thời gian lưu (tR) của các pic đồng phân ATN, IS và giá trị tỷ lệ diện tích giữa các pic đồng phân ATN với IS đều có độ lặp lại tốt (RSD < 2%). Hai pic S- và R-ATN tách hoàn toàn với Rs trung bình > 5, chứng tỏ hệ thống LC-MS/MS ổn định và phù hợp để định lượng đồng thời các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương.

b. Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp LC-MS/MS

Phân tích các mẫu chuẩn R-ATN, S-ATN; các mẫu HT trắng và các mẫu HT tự tạo chứa các chuẩn ATN với nồng độ khoảng 2,5 ng/ml đối với các chuẩn đồng phân hoặc 5 ng/ml đối với chuẩn racemic (bằng khoảng 1/60 Cmax ở người uống liều đơn 50 mg ATN) và có chứa nội chuẩn theo phương pháp đã được xây dựng.

SKĐ các mẫu chuẩn, mẫu HT trắng, mẫu HT tự tạo chứa chuẩn R-ATN, S-ATN và R,S-ATN được trình bày ở Hình 3.30.

RT:0.00 - 7.50

0 2 4 6

T ime (min) 0

20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

Relative Abundance

0 20 40 60 80

100 6.07

0.12 2.09

3.17 3.77 7.00

6.07 0.12 2.09

3.17 3.77 7.00

1.16 2.10 3.64

4.05 6.29 NL:

1.27E1 TIC M S B L

NL:

1.27E1 TIC F: + c ESI SRM ms2 267.000 [189.750-190.250]

M S B L

NL:

1.35 TIC F: + c ESI SRM ms2 346.100 [197.750-198.250]

M S B L

RT:0.00 - 6.80

0 2 4 6

T ime (min) 0

20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

Relative Abundance

0 20 40 60 80

100 4.29

6.17 1.07 1.95 3.44

1.07 1.95 3.44 3.58 5.58

RT: 4.29

NL: 6.81E3 TIC MS 5-1-0

NL: 1.08E1 TIC F: + c ESI SRM ms2 267.000 [189.750-190.250]

MS 5-1-0

NL: 6.81E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 346.100 [197.750-198.250]

MS Genesis 5-1-0

a. SKĐ mẫu huyết tương trắng b. SKĐ mẫu HT trắng có IS

RT:0.00 - 6.80

0 2 4 6

T ime (min) 0

20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

Relative Abundance

0 20 40 60 80

100 4.27

3.54 5.61 0.06 1.99

RT: 5.61

RT: 4.27

NL: 8.30E3 TIC MS S-L1

NL: 5.55E2 TIC F: + c ESI SRM ms2 267.000 [189.750-190.250]

MS Genesis S-L1

NL: 8.30E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 346.100 [197.750-198.250]

MS Genesis S-L1

RT:0.00 - 6.80

0 2 4 6

Time (min) 0

50 100 0 50 100

Relative Abundance

0 50

100 4.29

3.56 5.63

0.59 1.63

RT: 3.56 SN: 90

RT: 5.63 SN: 148

RT: 4.29 SN: 10493

NL: 7.79E3 TIC MS C1

NL: 1.62E2 TIC F: + c ESI SRM ms2 267.000 [189.750-190.250]

MS Genesis C1

NL: 7.79E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 346.100 [197.750-198.250]

MS Genesis C1

c. SKĐ mẫu HT thêm chuẩn S-ATN và IS d. SKĐ mẫu HT có chuẩn R,S-ATN và IS Hình 3.30. SKĐ tính chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp LC-MS/MS định lượng

các đồng phân đối quang atenolol trong huyết tương Chú giải hình: SKĐ tổng các ion (TIC): Cửa sổ trên cùng

SKĐ chọn lọc ion atenolol (SRM, m/z: 267  190): Cửa số giữa SKĐ chọn lọc ion nội chuẩn (SRM, m/z: 346  198): Cửa sổ dưới.

Trên sắc đồ mẫu HT trắng, các SKĐ tổng các ion; SKĐ chọn lọc ion ATN (m/z:

267  190) và SKĐ chọn lọc ion IS (m/z: 346  198) đều không xuất hiện pic (Hình 3.30a). Sắc ký đồ chọn lọc ion ATN (m/z: 267  190) các mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn S-ATN nồng độ 2,5 ng/ml (Hình 3.30c) và R,S-ATN nồng độ 5 ng/ml (Hình 3.30d) xuất hiện các pic có thời gian lưu lần lượt là 3,7 và 5,6 phút tương ứng với các đồng phân R-ATN và S-ATN. Trên SKĐ (Hình 3.30d), các pic đồng phân tách nhau hoàn toàn và có hình dạng cân đối.

Kết quả phân tích cũng cho thấy, tín hiệu đo của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của R-ATN và S-ATN (3,7 phút và 5,6 phút) nhỏ hơn 2% tín hiệu đo của pic R-ATN và S-ATN ở nồng độ 2,5 ng/ml. Tín hiệu đo của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS (4,3 phút) không vượt quá 1% tín hiệu đo của IS. Do vậy, phương pháp đặc hiệu-chọn lọc đối với R-ATN và S-ATN.

c. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Tiến hành pha các mẫu HT chứa chuẩn R-ATN và S-ATN cùng có nồng độ khoảng từ 2,5 ng/ml đến 500 ng/ml như đã trình bày ở Mục 2.3.2.2. Phân tích các mẫu theo quy trình đã xây dựng, ghi lại SKĐ và diện tích các pic ATN, IS của mỗi lần sắc ký. Xác định sự tương quan giữa nồng độ R-ATN (x1) và S-ATN (x2) có trong mẫu với giá trị tỷ lệ diện tích pic R-ATN/IS (y1), S-ATN/IS (y2) bằng phương pháp hồi quy tuyến tính, sử dụng hệ số tỷ trọng (1/nồng độ2).

Kết quả xác định mối tương quan được trình bày trong Bảng 3.19 và Bảng 3.20.

Bảng 3.19. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính của R-Atenolol Nồng độ R-ATN

(ng/ml) – x1

2,5 5,0 10,1 25,2 50,5 151,5 302,9 504,9 Diện tích pic

R-ATN 1217 2629 5188 12549 24818 72020 147991 199362

Diện tích pic

IS 185668 187265 196692 187131 191919 193486 198550 163650 Tỷ lệ D.tích pic

R-ATN/IS – y1

6,566 x 10-3

1,404 x 10-2

2,638 x 10-2

6,706 x 10-2

1,293 x 10-1

2,722 x 10-1

7,454

x 10-1 1,218 Độ đúng (%)* 95,8 106,6 101,7 104,5 101,1 97,2 97,4 95,5

Phương trình hồi quy (PTHQ): y1 = 0,0025x1 + 0,0004; r = 0,9988 (*) Độ đúng = (Nồng độ xác định từ PTHQ : Nồng độ lý thuyết trong mẫu)×100%

Bảng 3.20. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính của S-Atenolol Nồng độ S-ATN

(ng/ml) – x2

2,6 5,2 10,3 25,8 51,6 154,8 309,5 515,8 Diện tích pic

S-ATN 1237 2609 5277 12842 24659 72759 151681 200796

Diện tích pic

IS 185668 187265 196692 187131 191919 193486 198550 163650 Tỷ lệ D.tích pic

S-ATN/IS – y2

6,662 x 10-3

1,393 x 10-2

2,683 x 10-2

6,862 x 10-2

1,285 x 10-1

3,760 x 10-1

7,639

x 10-1 1,227 Độ đúng (%)* 96,6 104,7 102,4 105,8 99,4 97,2 98,8 95,2

Phương trình hồi quy (PTHQ): y2 = 0,0025x2 + 0,0004; r = 0,9990 (*) Độ đúng = (Nồng độ xác định từ PTHQ : Nồng độ lý thuyết trong mẫu)×100%

Kết quả thẩm định cho thấy, trong khoảng nồng độ từ 2,5 đến 500 ng/ml có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ các ĐPĐQ của ATN và tỷ lệ diện tích pic đồng phân/IS với hệ số tương quan lớn hơn 0,99. Nồng độ R-ATN và S-ATN xác định từ đường chuẩn so với giá trị lý thuyết đều đạt xấp xỉ 100% và nằm trong giới hạn cho phép (85 – 115%, trừ điểm nồng độ nhỏ nhất có thể đạt từ 80 đến 120%).

d. Giới hạn định lượng dưới của phương pháp

Phân tích các mẫu HT trắng và mẫu HT chứa R-ATN và S-ATN với cùng nồng độ khoảng 2,5 ng/ml (mẫu LLOQ). Xác định nồng độ R-ATN, S-ATN có trong các mẫu bằng phương trình hồi quy của đường chuẩn tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.

Kết quả xác định giới hạn LLOQ của phương pháp được trình bày ở Bảng 3.21.

Bảng 3.21. Giá trị LLOQ của phương pháp LC-MS/MS Số

tt

Tỷ lệ diện tích pic Nồng độ (ng/ml) Độ đúng (%) Giá trị S/N của pic R-ATN/IS S-ATN/IS R-ATN S-ATN R-ATN S-ATN R-ATN S-ATN 1 6,97x10-3 7,20x10-3 2,6 2,7 102,4 107,2 >10 >10 2 7,56x10-3 7,74x10-3 2,8 2,9 111,6 115,7 >10 >10 3 6,89x10-3 6,19x10-3 2,6 2,3 101,1 91,2 >10 >10 4 7,13x10-3 6,46x10-3 2,6 2,4 104,9 95,5 >10 >10 5 7,08x10-3 7,03x10-3 2,6 2,6 104,0 104,5 >10 >10 6 7,03x10-3 7,18x10-3 2,6 2,7 103,3 106,8 >10 >10

Trung bình (%) 104,5 103,5

CV (%) 3,5 8,5

Kết quả thẩm định ở Bảng 3.21 cho thấy, giá trị S/N của các pic R- và S-ATN trong các mẫu LLOQ (nồng độ 2,5 ng/ml) đều > 10. Tỷ lệ nồng độ R-ATN và S-ATN xác định từ đường chuẩn so với nồng độ thực có trong mẫu đều trong khoảng 80% – 120% đáp ứng yêu cầu giới hạn LLOQ của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

e. Ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích

Tiến hành xử lý các lô HT trắng có nguồn gốc khác nhau theo phương pháp chiết lỏng – lỏng với chloroform đã được xây dựng ở trên và thu các dịch chiết nền mẫu. Chuẩn bị các mẫu LQC, HQC chứa chuẩn R-ATN, S-ATN có nồng độ khoảng 7,5 ng/ml và 400 ng/ml trong các dịch chiết nền mẫu HT trắng thu được ở trên. Song song chuẩn bị các mẫu chuẩn R-ATN, S-ATN trong pha động có cùng nồng độ tương ứng.

Tiến hành phân tích LC-MS/MS, xác định diện tích các pic R-ATN, S-ATN và IS của các mẫu pha trong pha động và mẫu pha trong dịch chiết nền mẫu.

Đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu dựa trên tỷ số MFR-ATN/MFIS và MFS-ATN/MFIS

trong đó MFR-ATN, MFS-ATN, MFIS lần lượt là tỷ số diện tích các pic R-ATN, S-ATN, IS của các mẫu chuẩn pha trong dịch chiết nền mẫu và các mẫu chuẩn pha trong pha động có nồng độ tương đương.

Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu được trình bày trong Bảng 3.22.

Bảng 3.22. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu

STT MFR-ATN MFS-ATN MFIS MFR-ATN/MFIS MFS-ATN/MFIS

LQC HQC LQC HQC LQC HQC LQC HQC LQC HQC 1 0,96 0,92 0,94 0,85 0,92 0,91 1,05 1,00 1,03 0,93 2 0,94 0,90 0,97 0,89 0,87 0,87 1,08 1,03 1,11 1,02 3 0,95 0,92 0,96 0,90 1,03 1,00 0,92 0,92 0,93 0,90 4 0,97 0,90 0,98 0,90 0,85 0,86 1,14 1,05 1,15 1,04 5 0,98 0,91 1,00 0,91 0,94 1,01 1,05 0,90 1,06 0,90 6 0,97 0,99 0,99 0,98 0,95 1,08 1,02 0,92 1,04 0,91 TB 0,96 0,92 0,97 0,90 0,93 0,95 1,04 0,97 1,05 0,95 CV(%) 1,6 3,6 2,1 4,9 6,8 9,1 6,9 7,0 7,2 6,8

Kết quả thực nghiệm cho thấy, tỷ số MFR-ATN/MFIS và MFS-ATN/MFIS ở cả hai mức nồng độ thấp và cao đều có giá trị CV trong khoảng từ 6,8% đến 7,2% (nhỏ hơn 15%), chứng tỏ phương pháp xử lý mẫu phù hợp, nền mẫu không ảnh hưởng đến kết quả phân tích các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương.

f. Độ đúng, độ chụm của phương pháp

Tiến hành thẩm định độ đúng, độ chụm của phương pháp trên 4 lô mẫu LLOQ, LQC, MQC và HQC chứa R-ATN và S-ATN có cùng nồng độ tương ứng là 2,5; 7,5; 200;

400 àg/ml. Mỗi ngày, tại mỗi mức nồng độ phõn tớch LC-MS/MS tối thiểu 6 mẫu. Xỏc định hàm lượng R-ATN và S-ATN có trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn. Độ đúng là tỷ lệ % giữa nồng độ xác định được từ đường chuẩn so với nồng độ lý thuyết.

Độ chụm là độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả phân tích.

Kết quả xác định độ đúng, độ chụm của phương pháp đối với từng ĐPĐQ của ATN được trình bày ở Bảng 3.23 và Bảng 3.24.

Bảng 3.23. Độ chính xác trong ngày và khác ngày của R-Atenolol

Ngày Mẫu LLOQ Mẫu LQC Mẫu MQC Mẫu HQC Nồng độ

(ng/ml)

Độ đúng (%)

Nồng độ (ng/ml)

Độ đúng (%)

Nồng độ (ng/ml)

Độ đúng (%)

Nồng độ (ng/ml)

Độ đúng (%)

I

1 2,75 107,0 6,93 91,4 183,44 90,8 354,23 87,7 2 2,82 109,5 7,01 92,6 219,04 108,5 421,60 104,4 3 2,74 106,4 7,04 92,9 232,23 115,0 405,66 100,4 4 2,97 115,5 6,99 92,3 185,83 92,0 408,33 101,1 5 2,91 112,9 6,91 91,3 223,01 110,4 416,79 103,2 6 3,02 117,5 7,63 100,7 223,59 110,7 352,13 87,2

II

1 2,82 109,5 7,69 99,6 197,90 96,1 385,56 93,6 2 2,61 101,4 8,14 105,4 191,17 92,8 387,99 94,2 3 3,03 117,6 7,69 99,6 191,04 92,8 428,73 104,1 4 2,63 102,4 8,02 103,9 189,17 91,9 385,05 93,5 5 2,74 106,3 8,26 106,9 195,94 95,2 367,30 89,2 6 2,75 106,7 8,15 105,6 190,12 92,3 389,89 94,7

III

1 2,96 115,0 7,29 96,2 199,06 98,6 386,88 95,8 2 2,90 112,7 8,25 109,0 199,43 98,7 387,19 95,9 3 2,95 114,4 7,46 98,6 195,97 97,0 411,41 101,9 4 2,92 113,5 8,28 109,4 188,00 93,1 393,02 97,3 5 2,96 114,9 8,18 108,0 200,12 99,1 368,97 91,3 6 2,98 115,7 8,10 106,9 189,80 94,0 398,68 98,7

Trung bình 111,0 100,6 98,3 96,3

CV% 4,5 6,5 7,7 5,7

Bảng 3.24. Độ chính xác trong ngày và khác ngày của S-Atenolol

Ngày Mẫu LLOQ Mẫu LQC Mẫu MQC Mẫu HQC Nồng độa

(ng/ml)

Độ đúngb (%)

Nồng độa (ng/ml)

Độ đúngb (%)

Nồng độa (ng/ml)

Độ đúngb (%)

Nồng độa (ng/ml)

Độ đúngb (%)

I

1 2,79 108,3 7,18 94,6 182,33 90,1 363,87 89,9 2 2,93 114,0 7,17 94,4 215,22 106,4 388,14 95,9 3 2,94 114,2 7,08 93,3 222,05 109,7 399,45 98,7 4 2,86 111,2 6,94 91,4 187,89 92,8 382,25 94,4 5 3,01 117,0 6,91 91,1 230,15 113,7 399,25 98,6 6 2,92 113,3 7,72 101,8 217,18 107,3 362,44 89,5

II

1 2,85 110,4 6,87 92,3 190,47 96,0 378,45 95,4 2 2,37 91,8 7,67 103,0 186,53 94,0 380,51 95,9 3 2,77 107,5 7,65 102,9 186,86 94,2 430,21 108,4 4 2,80 108,7 7,55 101,5 189,83 95,7 376,97 95,0

5 2,43 94,1 7,23 97,1 193,88 97,7 359,66 90,6

6 2,56 99,2 7,81 105,0 187,62 94,6 385,03 97,0

III

1 2,56 99,3 6,88 92,4 190,53 96,0 373,69 94,2

2 2,62 101,6 7,81 105,0 190,99 96,3 376,91 95,0 3 2,62 101,6 7,06 94,9 190,34 95,9 396,47 99,9 4 2,82 109,2 7,85 105,6 181,40 91,4 383,88 96,7 5 2,70 104,6 7,59 102,0 196,13 98,9 361,12 91,0 6 2,66 103,3 7,76 104,3 183,12 92,3 392,04 98,8

Trung bình 106,1 98,5 97,9 95,8

CV% 6,7 5,5 6,9 4,6

(a)Tính từ phương trình hồi quy; (b) % so với nồng độ thực

Kết quả thẩm định cho thấy ở các khoảng nồng độ thấp, trung bình và cao, phương pháp đều có giá trị độ đúng trong ngày (ngày 1, 2 hoặc 3; n = 6) và độ đúng khác ngày (3 ngày; n = 18) nằm trong giới hạn cho phép từ 85% - 115% (trừ nồng độ LLOQ độ đúng cho phép từ 80% đến 120%). Độ chụm trong ngày và độ chụm khác ngày đáp ứng quy định (giá trị CV% ở bốn khoảng nồng độ đối với R-ATN và S-ATN đều nhỏ hơn 15%). Phương pháp LC-MS/MS phân tích các ĐPĐQ của ATN trong HT người nghiên cứu trong luận án đáp ứng các yêu cầu về độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học theo hướng dẫn của US-FDA và EMA.

g. Độ thu hồi hoạt chất

Độ thu hồi R-ATN, S-ATN và IS được xác định bằng cách so sánh diện tích pic R-, S- ATN và IS trong các lô mẫu HT đã được xử lý chiết lỏng – lỏng với chloroform và các mẫu có nồng độ tương ứng pha trong pha động (không tiến hành chiết với chloroform theo quy trình).

Kết quả xác định độ thu hồi hoạt chất và nội chuẩn của phương pháp được trình bày ở các Bảng 3.25 và Bảng 3.26.

Bảng 3.25. Độ thu hồi các đồng phân đối quang atenolol của phương pháp

Số thứ tự

Mẫu LQC Mẫu MQC Mẫu HQC

Huyết tương Pha động Huyết tương Pha động Huyết tương Pha động Diện tích pic R-Atenolol

1 3313 6360 83777 166855 166088 309932

2 3400 6660 86413 158029 176040 315496

3 3441 6360 88207 160458 169639 312333

4 3365 6270 85255 162897 173025 303136

5 3373 6384 79880 167315 170313 317665

6 3656 6338 85758 163468 162320 315752

Trung bình 3425 6395 84881 163170 169571 312386

CV (%) 3,5 2,1 3,4 2,2 2,9 1,7

Độ thu hồi * 89,2% 86,7% 90,5%

Số thứ tự Diện tích pic S-Atenolol

1 3233 5974 78962 151467 162443 306983

2 3272 6555 80516 149911 153705 310589

3 3262 6034 79980 153503 158419 302576

4 3147 5960 81737 143962 153613 304914

5 3178 6093 85019 160466 161085 307088

6 3488 6141 78993 163124 160918 305934

Trung bình 3263 6126 80868 153739 158364 306347

CV (%) 3,7 3,6 2,8 4,6 2,4 0,9

Độ thu hồi * 88,8% 87,7% 86,2%

(*): Giá trị đã được nhân hệ số pha loãng 5/3 của quy trình xử lý mẫu.

Bảng 3.26. Độ thu hồi nội chuẩn esomeprazol của phương pháp

Số thứ tự Diện tích pic esomeprazol trong các mẫu

Mẫu huyết tương Mẫu pha động

1 124299 231022

2 122744 232692

3 120848 235313

4 125538 233103

5 131618 228067

6 131816 216786

Trung bình 126144 229497

CV (%) 3,6 2,9

Độ thu hồi * 91,6%

(*): Giá trị đã được nhân hệ số pha loãng 5/3 của quy trình xử lý mẫu.

Kết quả thực nghiệm cho thấy, phương pháp có độ thu hồi các hoạt chất và nội chuẩn cao và lặp lại. Độ thu hồi S-ATN, R-ATN ở cả ba khoảng nồng độ thấp, trung bình và cao đều đạt xấp xỉ 90% với CV < 5%. Độ thu hồi S-ATN đạt 86,2% - 88,8%.

Độ thu hồi R-ATN đạt 86,7% - 90,5%. Độ thu hồi IS đạt 91,6% (CV < 5%, n = 6).

h. Nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất trong huyết tương

Độ ổn định của hoạt chất trong các mẫu huyết tương bảo quản ở một điều kiện nhất định được xác định dựa trên so sánh nồng độ hoạt chất có trong các mẫu đã được bảo quản so với nồng độ hoạt chất ban đầu hoặc nồng độ hoạt chất trong mẫu chuẩn bị song song nhưng được tiến hành phân tích ngay mà không trải qua quá trình bảo quản.

Theo quy định hoạt chất cần phân tích phải được nghiên cứu độ ổn định trong quá trình xử lý, phân tích và bảo quản mẫu.

 Độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu

Chuẩn bị các lô mẫu HT chứa R-ATN hoặc S-ATN nồng độ thấp (LQC) và nồng độ cao (HQC). Tiến hành phân tích xác định nồng độ hoạt chất trong các mẫu. Mỗi mức nồng độ phân tích 6 mẫu. So sánh nồng độ R- và S-ATN trong các mẫu HT được bảo quản 6 giờ ở nhiệt độ phòng và các mẫu được phân tích ngay sau khi chuẩn bị để đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong quá trình xử lý mẫu.

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.27.

Bảng 3.27. Độ ổn định của ATN trong mẫu HT bảo quản 6 giờ ở nhiệt độ phòng

Số thứ tự

Nồng độ (ng/ml)

Mẫu LQC Mẫu HQC

R-ATN S-ATN R-ATN S-ATN

Ban đầu

Sau 6h

Ban đầu

Sau 6h

Ban

đầu Sau 6h Ban

đầu Sau 6h

1 7,75 7,11 7,70 7,65 405,5 410,7 399,5 408,2

2 7,56 7,85 7,61 7,70 408,6 397,5 405,6 402,1

3 7,80 7,25 7,86 7,90 400,1 403,5 410,2 400,7

4 7,71 7,97 7,67 7,77 395,8 408,2 400,5 402,4

5 7,93 7,68 7,83 8,02 414,2 390,6 406,5 394,6

6 7,32 7,74 7,35 7,22 411, 8 394,8 402,8 398,6 Trung bình 7,68 7,60 7,67 7,71 406,0 400,9 404,2 401,1 CV (%) 7,75 7,11 7,70 7,65 1,7 2,0 1,0 1,1

Sai khác -1,0% 0,5% -1,3% -0,8%

Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ R-ATN và S-ATN trong mẫu LQC và HQC được xử lý ngay theo qui trình so với nồng độ R-ATN và S-ATN trong mẫu HT được xử lý sau 6 giờ để tan chảy ở nhiệt độ phòng khác nhau dưới 15% và các giá trị CV đều nhỏ hơn 15%.

Các mẫu HT chứa R-ATN để bảo quản ở nhiệt độ phòng, trên SKĐ chọn lọc ion ATN (m/z: 267  190) chỉ xuất hiện một pic, không xuất hiện pic có tR trùng với tR

của S-ATN. Tương tự, SKĐ chọn lọc ion ATN của các mẫu HT chứa S-ATN cũng chỉ xuất hiện một pic, không có pic R-ATN.

Vì vậy, R-ATN và S-ATN trong HT ổn định tới 6 giờ khi bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng.

 Độ ổn định trong buồng tiêm mẫu (autosampler)

Chiết lỏng – lỏng các mẫu LQC, HQC chứa R- hoặc S-ATN với chloroform theo quy trình đã xây dựng. Tiến hành phân tích LC-MS/MS, xác định nồng độ hoạt chất trong các mẫu ngay sau khi chiết và sau mỗi 4 giờ bảo quản trong buồng tiêm mẫu ở 4 oC.

Kết quả nghiên cứu độ ổn định của ATN trong các mẫu HT sau khi đã xử lý chiết với chloroform và bảo quản trong buồng tiêm mẫu ở nhiệt độ 4 oC trong vòng 12 giờ được trình bày trong Bảng 3.28.

Bảng 3.28. Độ ổn định của ATN sau xử lý mẫu và bảo quản ở 4oC

Số thứ tự

Mẫu LQC Mẫu HQC

R-ATN (ng/ml) S-ATN (ng/ml) R-ATN (ng/ml) S-ATN (ng/ml) Ban

đầu

Sau 12h

Ban đầu

Sau 12h

Ban

đầu Sau 12h Ban

đầu Sau 12h 1 7,75 7,72 7,70 7,88 405,5 401,5 399,5 396,3 2 7,66 7,73 7,61 7,71 408,6 405,1 405,6 416,7 3 7,80 7,67 7,86 7,42 400,1 401,5 410,2 399,6 4 7,71 7,30 7,67 7,54 395,8 400,8 400,5 410,6 5 7,83 7,61 7,83 7,63 414,2 392,5 406,5 398,4 6 7,62 8,19 7,35 7,95 411,8 410,6 402,8 390,4 Trung bình 7,73 7,70 7,67 7,69 406,0 402,0 404,2 402,0 CV (%) 1,0 3,7 2,4 2,6 1,7 1,5 1,0 2,4

Sai khác -0,3% 0,2% -1,0% -0,5%

Kết quả thực nghiệm cho thấy, R-ATN và S-ATN trong dịch chiết mẫu ổn định tới 12 giờ khi bảo quản ở 4 oC.

 Độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông

Đông lạnh hoàn toàn các lô mẫu LQC, HQC chứa R-ATN, S-ATN ở -35 ± 5 oC sau đó để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau ba chu kỳ đông lạnh–rã đông liên tiếp, phân tích xác định nồng độ hoạt chất trong các mẫu và so sánh với nồng độ hoạt chất ban đầu.

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.29.

Bảng 3.29. Độ ổn định của ATN sau ba chu kỳ đông lạnh – rã đông

Số thứ tự

Mẫu LQC Mẫu HQC

R-ATN (ng/ml) S-ATN (ng/ml) R-ATN (ng/ml) S-ATN (ng/ml) Ban

đầu

Sau đông-rã

Ban đầu

Sau

đông-rã Ban đầu Sau

đông-rã Ban đầu Sau đông-rã 1 7,75 7,47 7,70 7,50 405,54 404,82 399,52 398,33 2 7,66 7,36 7,61 7,41 408,61 401,43 405,58 404,73 3 7,80 7,71 7,86 7,75 400,12 416,74 410,23 401,41 4 7,71 7,62 7,67 7,80 395,83 411,12 400,45 400,54 5 7,83 7,75 7,83 7,88 414,23 408,40 406,52 407,64 6 7,62 7,82 7,35 7,91 411,78 412,56 402,84 405,25 Trung bình 7,73 7,62 7,67 7,71 406,02 409,18 404,19 402,98

CV (%) 1,0 2,3 2,4 2,7 1,7 1,3 1,0 0,9

Sai khác -1,4% 0,5% 0,8% -0,3%

Kết quả cho thấy, R- và S-ATN trong HT ổn định qua 3 chu kỳ đông lạnh – rã đông.

 Độ ổn định dài ngày

Nghiên cứu độ ổn định của R-ATN, S-ATN trong HT bảo quản ở nhiệt độ -35 ± 5 oC sau 28 và 60 ngày. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.30.

Bảng 3.30. Độ ổn định dài ngày trong huyết tương của atenolol

Số thứ tự

Mẫu LQC Mẫu HQC

Nồng độ R-ATN (ng/ml)

Ban đầu Sau 28 ngày Sau 60 ngày Ban đầu Sau 28 ngày Sau 60 ngày

1 7,75 7,85 7,58 405,54 391,62 405,65

2 7,66 7,41 7,31 408,61 401,11 412,43

3 7,80 7,55 7,11 400,12 392,21 391,15

4 7,71 7,34 7,41 395,83 405,66 384,53

5 7,83 7,32 7,72 414,23 411,87 400,51

6 7,62 7,77 7,79 411,78 397,30 398,64

Trung bình 7,73 7,54 7,49 406,02 399,96 398,82

CV (%) 1,0 3,0 3,5 1,7 2,0 2,5

Sai khác + -2,4% -3,1% + -1,5% -1,8%

Nồng độ S-ATN (ng/ml)

1 7,70 7,21 7,66 399,52 386,33 382,42

2 7,61 7,33 7,36 405,58 395,21 380,32

3 7,86 7,70 7,74 410,23 403,55 405,25

4 7,67 7,29 7,48 400,45 399,65 400,01

5 7,83 7,61 7,45 406,52 385,76 383,49

6 7,35 7,10 7,07 402,84 403,68 401,47

Trung bình 7,67 7,37 7,46 404,19 395,70 392,16

CV (%) 2,4 3,2 3,2 1,0 2,0 2,9

Sai khác + -3,9% -2,7% + -2,1% -3,0%

Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ R-ATN và S-ATN giữa các mẫu HT bảo quản ở điều kiện -35 ± 5 oC trong 60 ngày và các mẫu HT mới pha khác biệt < 5,0%.

Các mẫu HT bảo quản đông lạnh, trên SKĐ chọn lọc ion ATN (m/z = 267  190) chỉ xuất hiện một pic có tR trùng với tR của S-ATN hoặc R-ATN. Như vậy R-ATN, S-ATN ổn định trong HT khi bảo quản ở -35 ± 5 oC trong vòng 60 ngày. Không có sự chuyển dạng giữa R-ATN và S-ATN trong quá trình xử lý, phân tích và bảo quản mẫu.